组织块贴壁法培养人肠系膜动脉平滑肌细胞的研究

国强华，宋维鹏，王庆胜，刘 丽

组织块贴壁法培养人肠系膜动脉平滑肌细胞的研究

国强华1，宋维鹏2，王庆胜1，刘 丽1

目的采用组织块贴壁法建立成人肠系膜动脉血管平滑肌细胞体外模型，为心血管疾病研究提供实验基础。方法运用组织块贴壁法对成人肠系膜动脉平滑肌细胞进行原代培养，用倒置显微镜和免疫组化进行细胞形态学观察和鉴定。结果运用组织块贴壁法成功获得大量单个成人肠系膜动脉平滑肌细胞，培养的细胞呈典型“峰－谷”样生长，免疫组化显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。经胰酶消化后可传20代。结论通过组织块贴壁法可以获得成人动脉平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cell，hVSMC)，为心血管疾病的实验研究提供良好的材料。

人;肠系膜动脉;平滑肌;细胞培养

动脉中膜的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)在心血管疾病发生中具有重要作用。研究表明，高血压、动脉粥样硬化、血管成形术后再狭窄等多种疾病的病理过程常伴有VSMC的舒缩、迁移、增殖和纤维化。动脉血管平滑肌细胞的培养已经被广泛用于心血管疾病发病机制的研究［1－3］。目前，国内外大多数实验室仍选用动物的动脉作为血管平滑肌细胞体外培养的来源［4，5］，很少采用成人动脉。尽管动物的血管平滑肌细胞较容易培养，但其生物学特性与人的血管平滑肌细胞存在不少的差异，特别是在基因表达、抗原特异性方面，据此得出的实验结果并不能准确反映人体的实际情况。本实验旨在通过组织块贴壁法建立稳定的成人动脉血管平滑肌细胞体外培养模型［6，7］，为开展相关实验打下良好的基础。

1 材料与方法

1.1 试剂及液体配置 DMEM/F12干粉(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所)、胰蛋白酶(Trypsin，Sigma公司)、EDTA(Boehringe公司)、青霉素、链霉素、生理盐水、PBS缓冲液、DHank’s液、25 ml塑料培养瓶(Coming公司)、抗平滑肌Actin单克隆抗体和免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物公司)。将培养液配成含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液，每毫升中加入100 U青霉素和100 μg链霉素，调 pH值为7.0;100ml DHank液中加0.25 g胰蛋白酶和0.125 g EDTA配成浓度为0.25%胰酶和0.0125%EDTA的混合溶液，调pH值为8.0。配好的试剂分装后－20℃冰箱中保存备用。

1.2 成人肠系膜动脉的分离 选择腹部外科手术中摘除的肠系膜动脉［供体年龄为(50±5)岁，无高血压及器质性心血管疾病］，该医疗行为得到秦皇岛市第一医院伦理委员会的许可。手术室中分离切取人肠系膜动脉5～8 cm，用生理盐水将血管内外的血迹反复冲洗干净，移入含20%胎牛血清的无菌DMEM/F12培养液中。

1.3 VSMC的原代培养 实验室超净台内，在PBS平衡液的无菌培养皿内，用眼科镊去除血管外膜及结缔组织，露出白色的中膜，放入另一无菌培养皿中，纵向剪开血管，将血管内壁冲洗数次，用无菌棉花轻轻擦拭数次以除去内膜只留取中膜，眼科镊夹取中膜组织，用1 ml含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液反复冲洗后，放入另一无菌培养皿中，滴少许含20%胎牛血清的DMEM/F12培养液，用眼科剪剪成1 mm的小块，用弯头吸管将小块移入25 ml培养瓶内，以3～5块/cm2密度均匀贴于培养瓶底，培养瓶底内加入1 ml含20%胎牛血清的无菌DMEM/F12培养液，缓慢竖直培养瓶，以培养液刚未浸没小块为宜，放至5%CO2、37℃培养箱干涸2～4 h后轻轻翻转，使小块刚好浸入培养液中，原代培养每3 d换1次液，待4～5周细胞长满培养皿后即可传代。

1.4 VSMC的传代培养 传代前1 d换液1次，传代时弃去原培养液，PBS轻轻冲洗2遍，加入0.25%胰蛋白酶和0.0125%EDTA的混合溶液2 ml，培养箱中消化90 s，镜下观察见细胞收缩变圆、间隙增宽，立即加入新鲜培养液4 ml终止消化，用弯头吸管将细胞均匀吹打下来，离心后制成细胞悬液，细胞计数板计数达到107个/ml，调整细胞浓度为105个/ml，按1∶2传代，每3 d换液1次，传代周期为6～9 d。

1.5 形态学观察及细胞鉴定

1.5.1 形态学观察 应用相差显微镜观察细胞大小、形态、生长特点及排列方式等。

1.5.2 免疫细胞化学染色 将第3代细胞胰蛋白酶消化后以105个/ml的细胞浓度接种于置有盖玻片的6孔培养板中培养，待细胞长至60%后取出细胞爬片，PBS清洗5次，每次5 min。用4%多聚甲醛固定20 min，再PBS冲洗5次，每次5 min，然后用抗平滑肌Actin单克隆抗体进行免疫细胞化学染色，以VSMC胞质出现棕黄色为阳性结果，同时计数阳性百分率。

2 结 果

2.1 体外培养生长情况 原代成人肠系膜动脉平滑肌细胞贴壁牢固，3～4周后细胞呈充分伸展梭型，4～5周后即可传代，传代后12 d即可贴壁，4～5 d可出现VSMC特有的“峰－谷”样生长，这是平滑肌特征性生长表现(图1)。

图1 hVSMC细胞体外培养生长情况

2.2 形态学观察和鉴定 倒置显微镜下观察细胞形态，未贴壁前细胞呈圆形或椭圆形，胞质密度高，不透明，胞核多为卵圆形，有多个核仁;贴壁后细胞胞质透明，彼此融合在一起，细胞呈梭形或多角形，核居中央，呈椭圆形(图2)。免疫组织化学检测平滑肌α－肌动蛋白表达呈阳性显示，细胞计数阳性率为98%。

图2 hVSMC细胞免疫组织化学鉴定反应产物呈棕黄色(×200)

3 讨 论

研究血管平滑肌细胞的生物学行为是且前探讨动脉粥样硬化发生发展的热点之一［6，7］，然而成人的血管平滑肌细胞(hVSMC)培养难度很大，目前大多数的实验室仍用较易培养的动物血管平滑肌细胞来代替hVSMC，但鉴于其生物学特性与人源细胞存有一定差异，特别是在基因表达、抗原特异性方面，故使用人的血管平滑肌细胞成为许多心血管疾病研究的理想材料［1，8］。

本实验成功地建立了用人的肠系膜动脉培养血管平滑肌细胞的体外模型，培养的平滑肌细胞呈典型“峰－谷”样生长，免疫组化显示胞浆内平滑肌肌动蛋白阳性表达。组织块贴壁法简单、经济，经过一定时间的初步训练，即可掌握相关的无菌操作和技术。本实验需注意以下几点:(1)培养液。选用DMEM/F12培养液，因其内Ca2+和Mg2+含量高，营养丰富并含有利于细胞生长的因子及成分，保证成人血管平滑肌细胞在体外培养生长良好。培养液配置时的pH值应在7.0左右，因为hVSMC耐酸不耐碱，在稍微偏酸性的环境下生长的比较好。(2)血清。胎牛血清比小牛血清好，原代培养时用20%(v/v)胎牛血清，传代培养时可改用l0%(v/v)胎牛血清。(3)组织块。不应剪切过小，1 mm2最合适，否则组织块损伤大，水分容易丧失，导致原代培养失败。组织块间距需2～3 mm，以保证细胞从组织块游出后有足够的生长空间并保持局部细胞密度的均匀，从而获得更多的原代细胞。(4)原代培养。如果有组织块未贴壁，可将其重新摆放至瓶底，干涸2～3 h后，使其重新贴壁，再浸没于培养液中。该法不会影响同瓶中其他已萌出细胞的生长。(5)细胞纯度。组织块贴壁法培养的平滑肌细胞纯度相对低，但是传代至第3代时，细胞的纯度即可达到95%以上，适于进行后期实验。(6)免疫组化。α－平滑肌肌动蛋白(α－SMA)是细胞内六种肌动蛋白亚类之一，在所有真核细胞中的表达都高度保守。它们沿微管组成了细胞骨架的主要成分，编码它的基因是相对局限于在血管平滑肌细胞中表达的少数几个基因之一，公认是血管平滑肌细胞表型转化的标志。

本研究建立了用人的肠系膜动脉培养血管平滑肌细胞的体外模型，所介绍的组织贴块法培养的成人肠系膜动脉平滑肌细胞，较为成熟，简单、经济、易行，可为心血管疾病病因、机制的研究和防治提供一个理想的实验材料。

［1］梁若斯，陈 德.成人动脉平滑肌细胞体外培养模型的建立［J］.中国现代医学杂志，2002，12(10):31－34.

［2］周晓莉，雷 寒，柳 青.血管平滑肌细胞的培养及鉴定［J］. 重庆医学，2005，34(6):877－878.

［3］吕 平，申海涛，张 浩.消化法培养大鼠脑血管平滑肌细胞［J］.中国药理学通报，2007，23(2):137－139.

［4］周晓莉，雷 寒，柳 青.小鼠主动脉平滑肌细胞的培养［J］. 基础医学与临床，2005，25(6):564－567.

［5］王生兰，苏 娟，徐一洲.大鼠血管平滑肌细胞体外培养的表型转换及其鉴定［J］.中国动脉硬化杂志，2008，10(4):268 －272.

［6］司徒镇强，吴军正.细胞培养［M］.西安:世界图书出版社，2004:71－77.

［7］蔡文琴.现代实用细胞与分子生物学实验技术［M］.北京:人民军医出版社，2003:13－16.

［8］郭永平，张敏芳，袁江姿.人脐动脉平滑肌细胞体外培养［J］. 上海交通大学学报，2007，27(9):1008－1091.

Experimental study of human mesenteric artery smooth muscle cell cultured by tissuepiece inoculation

GUO Qianghua，SONG Weipeng，WANG Qingsheng，and LIU Li.1.Department of Cardiology;2.ICU，Qinhuangdao First Hospital，Qinhuangdao 066000，China

ObjectiveTo establish a method for culture of human mesenteric artery smooth muscle cell(hVSMC)by tissuepiece inoculation in vitro and to provide new technology to study cardiovascular diseases.Methods The tissue－piece inoculation method was applied to cell primary culture of hVSMC.Morphology of the cells was observed by inverted microscopy and identified by immunohistochemical methods.Results A great quantity of single hVSMC were obtained by tissue－piece inoculation.The cultured hVSMC showed typical“peak and valley”pattern and immunohistochemical staining showed that all the cells were positive.Conclusions The hVSMC are obtained by tissue－piece inoculation.This method provides good study material to research cardiovascular diseases.

human beings;mesenteric artery;smooth muscle cells;cell culture

R541.3

国家十一五科技支撑计划资助课题(2006BMI01A03－2)

国强华，男，1979年出生。硕士，主治医师。主要从事老年心血管病研究。

066000，秦皇岛市第一医院:1.心内三科;2.重症医学科通讯作者:刘 丽，E－mail:lucy301bj@vip.sina.com

(2012－06－08收稿 2012－07－26修回)

(责任编辑 梁秋野)

临床经验总结