醋酸铅对豚鼠耳蜗橄榄束传出神经毒性的研究

高映勤 马静 张铁松 林建云 林垦 李正才 阮标

铅是广泛存在于自然界的一种重金属，随着现代工业的发展，铅随烟尘、矿尘、污水、废渣等多种载体进入工作区和生活环境，对机体生长发育、神经系统产生不可逆的损害。近年来，铅对听觉系统的损害已逐渐引起人们的重视，但其对听觉系统损害的确切机制和部位尚不清楚。内侧橄榄耳蜗传出神经系统对正常听觉发挥着重要作用，是进行音调定位组合并对双耳声音进行整合的场所，其功能在于提高听神经阈值，从而能在噪声环境中对足够的声信号源产生反应。铅中毒是否会导致耳蜗传出神经形态及功能异常的研究目前尚未见报道，本研究采用乙酰胆碱酯酶组织化学染色方法和畸变产物耳声发射(DPOAE)对侧声抑制效应检测，定量分析醋酸铅对豚鼠内侧橄榄耳蜗传出神经纤维的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂 醋酸铅(上海化学试剂厂分析纯030802)，临用前将醋酸铅溶于去离子水，配成浓度为0.25%的溶液；碘代乙酰硫胆碱为英国SIGMA公司生产。

1.2实验动物与造模方法 选用健康成年豚鼠70只，雌雄不拘，耳廓反射灵敏，体重250～300 g(昆明医学院动物科提供)。随机分为高铅组(30只)、低铅组(30只)和对照组(10只)。实验前喂养观察一周后，高铅组、低铅组分别按40 mg/kg和10 mg/kg醋酸铅腹腔注射，每天1次，连续1周，对照组腹腔注射生理盐水1 ml，连续一周。每组分别于停药后14天和28天各取15只分别行DPOAE对侧抑制效应及血铅含量检测后断头处死，进行耳蜗基底膜铺片染色。

1.3DPOAE检测 3%戊巴比妥40 mg/kg腹腔内注射麻醉后将豚鼠置于屏蔽室，应用ILO92(Nicolet，美国)耳声发射仪，将直径为2 mm的硅胶管制成自制探头套于与其配套的婴儿探头，封闭外耳道口。f2/f1=1.20，初始音强度为L1=65 dB SPL，L2=55 dB SPL，叠加次数80～120次，对侧均以随机顺序给以60 dB SPL白噪声，分别测试有无对侧白噪声时的DPOAE幅值，以DPOAE幅值大于本底噪声3 dB为引出标准，以2 kHz处幅值变化为准测出其抑制幅度。

1.4血铅含量的测定 采用石墨炉原子吸收法于各时间点分别检测各组动物血清铅的含量。

1.5乙酰胆碱酯酶组织化学染色 暴露耳蜗及卵圆窗、圆窗，去掉鼓膜张肌，开放蜗尖，新鲜配置的4%多聚甲醛行耳蜗灌流。固定24小时后，取出基底膜，浸入0.1 mol/L醋酸盐缓冲液30分钟。将样品移入新鲜配制的乙酰胆碱酯酶组化反应液[含6.5 ml 0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH=6.0)，5 mg碘代乙酰硫胆碱，0.5 ml 0.1 mol/L枸橼酸钠溶液，1 ml 30 mmol/L硫酸铜，1 ml 双蒸馏水和1 ml 5 mmol/L铁氰化钾溶液]在室温下作用30分钟，用0.1 mol醋酸盐缓冲液(pH=6.0)漂洗基底膜样品3次，每次1分钟；将样品移入1%硫化铵溶液显色1分钟；用0.1 mol/L硝酸钠溶液漂洗样品5次，每次1分钟；将样品浸入0.1%硝酸银溶液1分钟，用0.1 mol/L硝酸钠溶液漂洗样品1分钟后再用0.1 mol/L醋酸缓冲液漂洗1分钟[1]，将染色好的基底膜按解剖学位置分回截断，各回一一放在已滴好甘油的玻片上，盖片封片，显微镜观察。在网格测距器下计数100 μm基底膜内侧耳蜗橄榄束传出神经(media olivocochlear efferent nerve,MOC)纤维平均根数。

1.6统计学方法 采用SPSS10.0统计软件，对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，组间比较用最小显著差法(LSD)检验，相关性用相关分析，方差不齐用秩和检验。

2 结果

2.1各组豚鼠的血铅含量(表1) 低铅组和高铅组的血铅含量均比正常对照组显著增高(P<0.01)，但随着时间的延长，低铅组血铅浓度逐渐下降，而高铅组血铅代谢缓慢。染毒动物的血铅含量随剂量的增高而增加，存在确切的剂量-反应关系(r=0.799，P<0.01)。

2.2醋酸铅对豚鼠内侧橄榄耳蜗传出神经的影响 乙酰胆碱活性的反应产物为亚铁氰化铜棕黑色沉淀，清晰的定位在传出神经纤维及末梢。对照组MOC纤维及末梢在耳蜗各回的分布不一致(表1)，钩回、第一、二回传出神经分布差别不大，第三、第四回传出神经末梢逐渐减少，底回神经纤维较粗，而顶回纤维较细(图1)。高铅组停药2周后，传出神经纤维连续性中断，耳蜗乙酰胆碱酯酶终末反应物减少，以钩回、第一回神经纤维损伤严重(图2)，4周后钩回、第一回仅残留少量的神经末梢(图3)；低铅组耳蜗传出神经未见明显损伤(图4)。定量分析显示(表1)：醋酸铅可对豚鼠内侧橄榄耳蜗传出神经系统产生不可逆性的损害，钩回、第一回和停药后4周传出神经纤维损害最显著。经方差分析，高铅组MOC纤维平均根数较低铅组和对照组显著减少，差异有显著统计学意义(P<0.01)。

2.3DPOAE和对侧抑制效应测试结果 对照组和低铅组均引出DPOAE，并出现了不同程度的对侧声抑制现象，对照组对侧声抑制幅度3.64±1.70 dB，低铅组停药后14天和28天分别为3.06±1.19dB和2.86±1.33 dB，与对照组抑制幅值均值相比差异无统计学意义(P>0.05)。高铅组停药14天后，15耳中9耳未引出耳声发射，另6耳耳声发射存在，给予对侧白噪声后出现抑制现象，抑制幅度为0.65～1.38 dB，因多数无抑制现象，故其均值为0.74±0.61 dB，与对照组抑制幅值均值相比差异有统计学意义(P<0.05)；高铅组停药后28天DPOAE均未引出。

表1 各组豚鼠血铅含量、传出神经纤维在耳蜗的分布

注：*与对照组及低铅组同一时间比较，P<0.01

图1 正常耳蜗基底膜钩回传出神经密度均匀，纤维连续(×100)图2 高铅组用药2周后钩回神经纤维连续性中断，乙酰碱酯酶终末反应物减少(×100)图3 高铅组用药4周后钩回神经纤维绝大部分消失(×100)图4 低铅组用药4周后钩回神经纤维均匀，分布清晰(×100)

3 讨论

耳蜗橄榄束是将信息由大脑皮质或高位听觉中枢传至低位听觉中枢或外周听觉器官的传出神经束，其胞体位于上橄榄复合体内，其功能在于提高听神经阈值，使之对掩蔽噪声不太敏感从而能在噪声环境中对足够的信号源产生反应。听觉系统对铅的毒性较敏感，铅可对听觉系统产生持续的影响，但铅中毒对听觉系统损害的确切机制与部位仍不十分清楚。铅是一种强神经毒物，其神经毒性和神经系统细胞的凋亡有关[2]。铅通过对神经细胞膜的离子代谢、酶的活性、神经递质的释放、摄取和储存及第二信使系统的干扰，影响细胞和神经的代谢活动。细胞内游离的钙离子直接参与调节耳蜗传出神经系统的活动，包括去极化、复极化、神经递质的传递，在听觉系统传导和频率调谐方面起着重要的作用。铅能竞争性阻断细胞膜上Ca2+摄取和释放，使细胞膜的极性发生改变，阻止线粒体对Ca2+的摄取，干扰了细胞的能量代谢；铅中毒时神经元动员Ca2+的能力大幅度提高，导致神经元内Ca2+浓度升高，钙离子调节能力下降使细胞信号传导功能下降，从而引起细胞内一系列的生化过程[3]。

已有研究发现染铅Wistar大鼠的听性脑干反应波Ⅰ潜伏期延长，听功能明显下降，其原因可能是因为铅诱发组织中脂肪酸构成的变化及增加脂质过氧化物引起的听神经损害，同时还发现锌、硒对铅的毒性有拮抗作用，可保护大鼠由于铅中毒引起的听力损害[4]。研究证实机体易感性可能是铅毒性作用的决定因素，铅可通过抑制δ-氨基―γ―酮戊酸脱水酶的活性引起血红蛋白合成障碍和红细胞游离原卟啉增加，而造成间接的听神经毒性[5]。

本研究结果显示，支配耳蜗外毛细胞的传出神经纤维在耳蜗的分布密度不一致，耳蜗底回到顶回传出神经支配逐渐减少，越靠内排的毛细胞接收的传出纤维越多。大剂量铅中毒时(高铅组)耳蜗传出神经纤维受到明显的损害，随着染毒时间的延长损害程度呈进行性加重，并且以耳蜗钩回、第一回受损最明显，逐渐向顶回发展。小剂量的铅(低铅组)对豚鼠内侧橄榄耳蜗束未产生明显损害，这可能与传出神经的解剖学分布有关，另外，血铅浓度较低时铅可通过代谢逐渐排出，避免了铅持续长时间侵袭神经。耳蜗传出神经系统和外毛细胞形成突触，近年来有学者发现，铅可通过抑制突触终端的囊泡纤夫蛋白的活性使神经递质传递失平衡，囊泡纤夫蛋白是第一个被分离出来的突触囊泡整合蛋白，在神经组织和非神经组织中均有表达。铅可阻碍囊泡纤夫蛋白和突触前膜列阵蛋白的作用，导致囊泡导向与融合无法完成，因而干扰了耳蜗传出神经和外毛细胞间的突触传递[6]。

耳声发射已广泛用来探讨听觉传出神经系统与耳蜗微机械活动的关系，利用外毛细胞受橄榄耳蜗系统激活刺激，可以耳声发射对侧抑制幅度作为评估听觉传出系统功能指标，故本研究采用对侧声刺激诱发的DPOAE抑制幅度作为橄榄耳蜗传出系统功能测试的方法。文中结果显示，对照组和低铅组均引出DPOAE并出现了不同程度的对侧抑制现象，而高铅组停药后多数未引出DPOAE，且少数耳的对侧抑制幅度明显低于低铅组及对照组，这与耳蜗传出神经受损的形态学相符[7]。杨烽[8]通过大鼠原代培养技术发现铅能明显抑制大鼠皮层神经元的存活和突起成长，随着铅浓度的升高其抑制作用逐渐增大，存在着明显的剂量效应关系。本研究结果也证实了血铅浓度越高，其对耳蜗传出神经的损伤越重。

铅对耳蜗橄榄束的影响很可能是造成听觉系统损害的分子神经毒理学机制之一。由于耳蜗橄榄束和外毛细胞形成突触，并且铅中毒时皆可引起损伤，但两者损害之间是否存在着某种因果关系，其确切发生机制及其损害的关联性仍有待于深入研究。

4 参考文献

1 谢鼎华，主编.基础与应用听力学[M].长沙：湖南科学技术出版社,2003.152～153.

2 Adhikari N, Sinha N, Narayan R, et al.Lead-induced cell deaths in tests of young rats[J]. J Appl Toxicol,2001, 21:275.

3 Ddevoto P, Flore G, Ibba A, et al. Lead intoxicating during intrauterine life and lactation but not during adulthood reduces nucleus accumbens dopamine release as studied by brain microdialysis[J]. Toxicol Lett, 2001,121:199.

4 高希宝，史丽，玄永庆,等. 锌硒对铅致大鼠听力损伤的影响研究[J]. 微量元素与健康研究，2004，21:6.

5 Kelada SN，Shelton E, Kanfmann RB, et al. Dela-aminolevulinic acid dehydratase genotype and lead-toxicity: a huge review[J]. Am J Epidemiol, 2001, 154: 1.

6 Bouton CM, Frelin LP, Forde CE, et al. Synaptotagmin Ⅰis a molecular target for lead[J]. J Neurochem,2001，76:1 724.

7 Maison S，Micheyl C，Andeol G，et al．Activalion of medial olivocochlear efferent system in humans: influenee of stimulus band width[J]．Hear Res，2000，140：111．

8 杨烽，李积胜，杨芳.不同浓度醋酸铅对大鼠原代培养大脑皮层神经元的影响[J].中华劳动卫生职业病杂志,2004，22：217.