HPLC法测定罗库溴铵中溴丙烯的含量

聂忠莉，王晓玲，欧世荣，张 勇

(1.成都大学生物产业学院，四川成都 610106;2.成都欣捷高新技术开发有限公司，四川成都 610041)

0 引言

罗库溴铵(Rocuronium Bromide，Roc)是一种新型非去极化甾醇类肌松药物，能对神经—肌肉接点产生阻滞作用，可暂时性干扰神经—肌肉间兴奋的传递而使骨骼肌松弛［1］.临床上用于全神麻醉辅助，维持术中肌松［2，3］.由于罗库溴铵生产工艺中使用了较大量的溴丙烯，其可能产生残留而对人体造成伤害，且目前欧洲药典［4］和USP［5］公示标准均未收载溴丙烯的检测方法.故本实验对溴丙烯含量的测定进行了研究，建立了一种基于HPLC法的检测方法，并对其进行了方法学验证.实验表明，本检测方法操作简单，专属性强，精密度好，结果准确可靠，将其收载到罗库溴铵质量标准中，可确保该产品的质量可靠及用药的安全性.

1 仪器与试药

1.1 仪 器

实验所用仪器包括:LC-10ATvp/SPD-10Avp高效液相色谱仪(日本岛津公司)，TU-1800SPC紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，pHS-3C酸度计(上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂).

1.2 试 药

实验所用药品包括:罗库溴铵(批号，081201、081202、090101)由成都新恒创药业有限公司提供，溴丙烯对照品来源于SIGMA-ALDRICH，四甲基氢氧化铵、乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯，水为超纯水.

2 方法与结果

2.1 检测波长确定

2.2 色谱条件

通过实验分析确定，本实验的色谱条件为:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以四甲基氢氧化铵溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸调节pH值至5.0)—乙腈(4∶6)为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长为210 nm.

2.3 溶液配制

(1)溴丙烯对照溶液的制备.精密称取溴丙烯对照品25.12 mg置25 mL量瓶中，用乙腈—水(9∶1)溶解并稀释至刻度，摇匀.再精密量取1 mL置100 mL量瓶中，用乙腈—水(9∶1)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液.

(2)供试品溶液的制备.精密称取罗库溴铵(081201)104.01 mg置10 mL量瓶中，用乙腈∶水(9∶1)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液.

2.4 系统适用性试验

取上述溴丙烯对照溶液和供试品溶液，按“2.2”项下条件进样，记录色谱图，结果如图1所示.

图1 溴丙烯HPLC图谱

从图1可知，溴丙烯在7.075 min出峰，而罗库溴铵样品中溴丙烯与前后杂质峰的分离度为4.25/ 3.98，分离度好，理论塔板数13 460(大于10 000).

2.5 专属性试验

精密称取罗库溴铵样品适量分别进行强酸、强碱、氧化、高温和光照破坏性试验.并取上述专属性试验样品溶液，分别进样.实验发现，样品中溴丙烯主峰与各杂质峰能够得到很好分离，证明实验色谱条件专属性良好.同时，从各破坏试验的图谱显示，在各实验条件下，溴丙烯的峰高都有所增加，氧化破坏增加最大，碱破坏最小.此也说明罗库溴铵在生产和贮藏过程中应检测和控制溴丙烯的含量.

2.6 重复性和稳定性试验

精密称取溴丙烯对照品适量，用乙腈—水(6∶4)配制成0.01 mg/mL的溶液，作为供试品溶液.精密量取该溶液5 μL进样，记录色谱图，并重复操作6次，其峰面积的RSD计算值为0.9%.精密称取罗库溴铵(081201)适量，用乙腈—水(6∶4)配制成10.0 mg/mL的溶液，作为供试品溶液，分别于，0 h、1 h、2 h、4 h、6 h，各精密量取该溶液5 μL进样测定，记录色谱图，其峰面积的RSD计算值为1.5%.实验结果表明，供试品溶液重复性良好，且在6 h内相对稳定.

2.7 检测限和定量限

精密称取溴丙烯对照品适量，分别加乙腈—水(6∶4)逐级稀释成101.28 ng/mL、40.512 ng/mL、20.256 ng/mL、10.128 ng/mL的溶液，作为供试品溶液.按实验色谱条件，分别取上述溶液各5 μL注入液相色谱仪.实验结果表明:浓度为10.128 ng/ mL的溶液的峰高为噪音峰高的3.4倍，以S/N=3时计算，检测限为0.044 ng;浓度为40.512 ng/mL的溶液的峰高为噪音峰高的10.0倍，以S/N=10时计算，定量限为0.203 ng.

隧道管片的受力比较接近于单向受力状态，管片的疲劳寿命是由其拉、压状态共同决定的。因此，采用单轴受拉疲劳经验公式(7)[29]来对管片进行受力计算，采用单轴受压疲劳经验公式(8)[30]对管片的疲劳寿命进行验算，其计算公式如下：

2.8 线性实验

精密称取溴丙烯对照品适量，用乙腈∶水(6∶4)制成不同浓度的溶液，按实验色谱条件，分别进样5 μL，并记录主峰面积，结果如表1所示.

表1 溴丙烯线性实验

以峰面积(A)为纵坐标，供试品浓度(C)为横坐建立线性方程，并进行回归处理，其结果如图2所示.

图2 溴丙烯含量测定线性关系图

当溴丙烯浓度在0.528 μg/mL～105.6 μg/mL的浓度范围内，峰面积和浓度呈线性关系，其线性方程为，

此表明，溴丙烯在此浓度范围内线性关系良好.

2.9 加样回收率试验

(1)对照品溶液.精密称取溴丙烯对照品适量，加乙腈—水(6∶4)配制成10 μg/mL的溶液，摇匀即得.

(2)供试品溶液.精密称取溴丙烯对照品适量，分别用乙腈∶水(6∶4)配制成76.12 μg/mL、106.24 μg/mL、128.72 μg/mL的溶液，摇匀，作为储备液;再精密称取罗库溴铵(081201)样品11份，每份约100 mg，分别置10 mL量瓶中，其中9份分别用加入3种浓度的储备液各1.0 mL，每个浓度各取3份并用乙腈—水(6∶4)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，其余2份分别用乙腈—水(6∶4)溶解并稀释至刻度，摇匀，作为样品溶液.

(3)测定法.分别精密量取上述各溶液5 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算.

溴丙烯回收率实验结果如表2所示.

表2 溴丙烯回收率实验结果

表2数据表明，在本实验色谱条件下，样品回收率较好，能准确地测定出罗库溴铵样品中溴丙烯的含量.

2.10 测定方法

(1)采用高效液相色谱法测定，并严格按照2010年版《药典》(二部)相关要求进行.

(2)色谱条件与系统适应性试验.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以四甲基氢氧化铵溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸调节pH至5.0)—乙腈(4∶6)为流动相;流速:1.0 mL/min;检测波长为210 nm;理论塔板数按溴丙烯峰计算应不低于10 000.

(3)测定法.取溴丙烯对照品适量精密称定，加乙腈—水(6∶4)溶解并定量稀释制成每1 mL中约含10 μg的溶液，作为对照品溶液;另取罗库溴铵样品适量，加乙腈—水(6∶4)溶解并定量稀释制成每1 mL中约含10.0 mg的溶液，作为供试品溶液.分别精密量取对照品溶液和供试品溶液各5 μL注入液相色谱仪，记录色谱图.如供试品图谱中与溴丙烯对照品主峰相同保留时间处出现杂质峰，按外标法以峰面积计算，不得过0.1%.

2.11 样品测定

取3批罗库溴铵样品，按“2.9”项下方法制备供试品溶液进样测定，按外标法以峰面积计算罗库溴铵中溴丙烯的含量，测量结果如表3所示.

表3 罗库溴铵样品中溴丙烯含量的测定结果

表3数据表明，3批罗库溴铵中溴丙烯的含量分别为0.0009%、0.0021%、0.0014%，均未超过0.1%.

3 讨论

溴丙烯在C18和硅胶柱峰均可与罗库溴铵及有关物质峰相分离，但溴丙烯硅胶柱峰的峰形较差，其保留时间与罗库溴铵的保留时间较近，且与前后峰之间的分离度较差，故本研究在实验时选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，其峰形好，保留时间恰当，与前后峰之间的分离度符合要求.

在实验中，参考《欧洲药典》中罗库溴铵的质量标准，对溴丙烯检测中的流动相、流速等条件进行了筛选，分别比较了流动相为四甲基氢氧化铵溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸调节pH值至7.4)—乙腈(1∶9)(2∶8)(3∶7)(4∶6)、四甲基氢氧化铵溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸调节pH值至7.0)—乙腈(4∶6)、四甲基氢氧化铵溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸调节pH值至4.0)—乙腈(4∶6)、四甲基氢氧化铵溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸调节pH值至5.0)—乙腈(4∶6).结果显示，流动相为四甲基氢氧化铵溶液(4.53 g→1 000 mL水，用磷酸调节pH值至7.0)—乙腈(4∶6)，流速为1.0 mL·min－1时，溴丙烯与前后峰之间的分离度最佳，故选之.

溴丙烯、罗库溴铵及有关物质在水和乙腈中均易溶解.本研究分别比较了用水、乙腈、水—乙腈(1∶9)、水—乙腈(4∶6)及流动相作为溶剂.结果显示，用水—乙腈(4∶6)作为溶剂时，其峰形好，基线稳定.

在3批罗库溴铵样品中，均定量检出溴丙烯，表明罗库溴铵质量标准中收载溴丙烯的检查项有其科学性和必要性.

综上所述，本研究建立的利用HPLC法测定罗库溴铵中溴丙烯的含量的方法灵敏度高、专属性强、结果准确可靠，故建议将本测定方法收载到罗库溴铵质量标准中，以确保罗库溴铵质量的可靠与用药的安全.

［1］裴凌，盛卓人.罗库溴铵欧洲研讨会综述［J］.国外医学—麻醉学与复苏分册，1995，16(4):219－221.

［2］孔颖.罗库溴铵用于麻醉诱导的临床观察［J］.海峡药学，2004，16(2):96－97.

［3］查显忠，夏晓琼.罗库溴铵用于全麻诱导气管插管的临床观察［J］.皖南医学院学报，2008，27(3):231－234.

［4］欧盟药典委员会.欧洲药典6.0［S］.斯特拉斯堡:欧洲药品质量管理局，2008:2835－2837.

［5］美国药典委员会.美国药典(USP)［EB/OL］.http:// www.usp.org/USPNF.

［6］国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)［M］.北京:化学工业出版社，2010.