脂肪酶催化制备丁酸乙酯的研究

沈咏梅，谢晓娜，荀二娜，王佳欣，张 弘，王 磊，王 智

(1.吉林大学白求恩医科大学制药厂，吉林长春 130021;2.吉林大学第一临床医院，吉林长春 130021; 3.吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，吉林长春 130023)

0 引言

丁酸乙酯是一种无色至微黄色透明液体，呈香蕉和菠萝的特殊香味，其天然品主要存在于草莓、橄榄等植物油中.在食品工业中，丁酸乙酯主要被用来配制香蕉、葡萄、草毒、菠萝和朗姆酒等香型的香料，此外，其在玫瑰油香精、烟用香精中亦有使用.在我国，它是GB2760－86规定允许使用的食用香料［1］.

目前，除了极少数的酯是由天然植物中提取以外，短链脂肪酸酯几乎全部都是通过传统的化学方法进行生产的，即在高温、高压条件下，由无机催化剂，如浓硫酸、对甲苯磺酸等催化合成.然而，化学生产不仅存在着催化剂可能带来有毒物质的问题，而且剧烈的反应条件也很容易产生有毒的副产物［2，3］.此外，采用微生物发酵方法也可以制备短链脂肪酸酯［4］，但该方法的主要缺点是产物的浓度低、代谢产物复杂，难以实现工业化大规模生产.近年来，随着科研人员对非水酶学研究的深入，酶在有机溶剂中催化功能的应用不断扩大，利用脂肪酶在有机相中具有较高酯化能力的特性，已经出现一些利用该方法催化制备短链脂肪酸酯的比较成功的例子［5，6］.酶法制备短链脂肪酸酯具有反应条件温和、节约能源、副产物少、产品品质高等优点，而且其产品可以被认作天然产物［7］.

在本研究中，我们采用脂肪酶BSL2(Bacillus subtilis lipase)作为催化剂，考察了由丁酸与乙醇在常压下直接酯化合成丁酸乙酯的可行性，同时，对其最适反应条件进行了筛选.

1 材料方法

1.1 仪器与试剂

实验所用脂肪酶BSL2由吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室自行克隆、表达［8］.丁酸、乙醇以及其他化学试剂均采用国产分析纯试剂.

1.2 脂肪酶BSL2粗酶制备

脂肪酶BSL2粗酶制备［8］的方法为:首先，将脂肪酶BSL2工程菌BSL按接种量的1%接种于硫酸卡那霉素的LB培养基上(5 mL，30 μg/mL)，恒温30℃下振荡培养20 h.然后，按1%的接种量接种于LB培养基上(200 mL)，恒温30℃振荡培养4 h后转接到2 L发酵LB培养基中，继续恒温30℃培养并监测其OD600值，当培养液OD600达到0.8～1.0时，将培养液进行离心分离(8，000 rpm，15 min)，收集菌体，将其置于－20℃的溶器中，冷冻过夜.其后，在室温下将菌体融化，加入pH值为8.5的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(约为菌体9倍体积)，同时加入溶菌酶(按1∶500(V/V)加入)，恒温4℃下将其消化1 h后离心(4℃，12 000 rpm，20 min)分离，收上清液得脂肪酶BSL2粗酶液.最后，用硫酸铵(40%饱和度)对粗酶液进行沉淀，所得到的上清液用硫酸铵(70%饱和度)进行沉淀，沉淀溶解后透析过夜，冻干备用.

1.3 初始水活度(aw)的控制

初始水活度(aw)的控制［9］方式为，通过直接向反应体系中加入水合盐对来控制体系水活度，并在基本反应体系中分别配置不同水活度为0.06(LiBr)、0.11(LiCl)、0.24(KCH3COO)、0.33(MaCl2)、0.53(Mg (NO3)2)、0.75(NaCl)和0.97(K2SO4)的反应体系.

1.4 脂肪酶催化丁酸乙酯的酯合成反应

脂肪酶催化丁酸乙酯的酯合成反应过程为，在20 mL正丁烷中(含有20 mg硅藻土，aw=0.33)加入丁酸(40 mmol/L)、乙醇(60 mmol/L)和100 mg酶粉，置于40℃振荡培养箱中进行反应.产物经GC分析测定丁酸转化率.酯合成反应速度(μmol/g· min)定义为，单位酶(g)在单位时间(min)内催化合成丁酸乙酯的量(μmol).

1.5 GC检测方法

GC检测方法为:岛津GC214B型气相色谱仪(GC)，Econo-CAP SE54毛细管柱(30 m×0.32 mm× 0.25 mm)，氢火焰检测器;载气N2(60 mL·min－1)，进样室温度200℃，检测室温度290℃.升温程序为:起始柱温110℃，保留1 min，升温速率15℃· min－1，最后温度210℃，保留2 min;进样量2 μL.

2 结果与讨论

影响脂肪酶在有机溶剂中催化合成丁酸乙酯反应的因素有很多，除了选择具有较高催化活性的脂肪酶之外，还有许多反应条件因素需要考虑.

2.1 反应介质

有机溶剂对酶活的影响是非水酶学所要阐明的重要因素.溶剂不但直接或间接地影响酶的催化活力和稳定性，而且也能够改变酶的特异性(包括底物特异性、立体选择性、前手性选择性等)，有机溶剂主要通过与水、酶、底物和产物的相互作用来影响酶的这些性质［10］.在实验中，我们选择了6种不同极性的有机溶剂，研究了反应介质对酶促丁酸乙酯合成反应的影响，结果如表1所示.

表1 反应介质对酶促丁酸乙酯合成反应的影响

表1数据表明，脂肪酶BSL2催化丁酸乙酯合成反应的反应速度随着有机溶剂极性的增加而下降，在所选择的6种有机溶剂中，正己烷作为反应介质时反应速度最快.这可能是由于极性较强的有机溶剂具有较强的亲水性，其剥夺酶分子必需水的能力较强，容易破坏酶分子的活性构象，因此在这类有机溶剂中，酶的催化活力通常不会太高.

2.2 反应温度

一般来说，反应温度越高反应速度越快，但在高温下酶分子作为一种蛋白质容易变性失活.本研究考察了反应温度对于脂肪酶BSL2催化丁酸乙酯合成反应的影响，结果如图1所示.

图1 反应温度对酶促丁酸乙酯合成反应的影响

实验结果表明，酯合成反应速度随着反应温度的升高呈现出“钟"形曲线，当反应温度为40℃时，脂肪酶BSL2催化合成丁酸乙酯的反应速度最快.

2.3 底物浓度和底物摩尔比

由于丁酸和乙醇都是具有较强极性的有机化合物，它们的浓度有可能直接影响到酶的催化活性和稳定性，并最终影响酶促反应的反应速度和转化率，故本研究分别考察了底物浓度和底物摩尔比对该反应的影响.

首先，固定丁酸浓度为40 mmol/L，通过改变反应体系中的乙醇量来调节酸醇摩尔比，考察了底物摩尔比对反应的影响，结果如图2所示.

图2 底物摩尔比对酶促丁酸乙酯合成反应的影响

实验结果表明，适当提高酸醇的摩尔比能够提高酯合成反应速度，而底物摩尔比太高则可能会抑制酶活，降低了反应速度.

通过实验发现，最适酸醇摩尔比为1∶1.5.固定底物摩尔比(1∶1.5)，调节丁酸的浓度，考察丁酸浓度对酯合成反应速度的影响，结果如图3所示.

图3 底物浓度对酶促丁酸乙酯合成反应的影响

实验结果表明，当丁酸浓度为40 mmol/L的时候，反应速度最快，进一步增大其浓度，反应速度开始下降，这可能是由于酶活被抑制的缘故.

2.4 加酶量的影响

不同加酶量对酶促丁酸乙酯合成反应速度也会产生影响.本研究分别取10 mg、50 mg、100 mg、150 mg和200 mg酶粉进行酶促酯合成反应，结果如图4所示.

图4 加酶量对酶促丁酸乙酯合成反应的影响

实验结果表明，酶促合成丁酸乙酯的反应速度随着酶量的增加而加快，当酶量达到100 mg时，反应速度达到最大，再增加酶其反应速度不会增加.

2.5 初始水活度的影响

在含微量水的有机介质中，酶的催化活性与反应体系的含水量密切相关［11］.一般来说，脂肪酶在完全无水的条件下是没有催化活性的，因为酶需要一定量的水才能维持其催化活性.在有机介质中，微量水直接参与了酶的水化作用，影响酶的催化活性和稳定性.本实验通过改变反应体系的水活度，并对此进行了研究，结果如图5所示.

实验结果表明，当系统初始水活度为0.33时，酯合成反应速度最大.

图5 水活度对对酶促丁酸乙酯合成反应的影响

2.6 酯化反应进程

在最适反应条件下(以正己烷为溶剂，丁酸浓度为40 mmol/L，乙醇浓度为60 mmol/L，加人0.1 g脂肪酶，40℃，aw=0.33)进行酶促丁酸乙酯合成反应，监测不同反应时间丁酸乙酯合成反应的转化率，结果如图6所示.

图6 酶促合成丁酸乙酯的反应时间进程

实验结果表明，随着反应时间的延长，酯合成反应的转化率不断增加，当反应时间为30 h的时候，酯合成反应基本达到平衡，此时反应转化率为94.8%.故确定最适反应时间为30 h.

3 结论

本研究利用脂肪酶BSL2作为催化剂，在有机相中催化合成丁酸乙酯.在研究中，考察了反应温度、加酶量、底物浓度、底物摩尔比、反应介质、初始水活度等反应条件对酶促合成丁酸乙酯的影响.试验结果表明，以正己烷为溶剂，初始水活度为0.33，加酶量为100 mg，丁酸浓度为40 mmol/L，底物摩尔比(丁酸/乙醇)为1∶1.5，在40℃条件下振荡反应30 h，合成丁酸乙酣的的转化率可达到94.8%.

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