HPLC法同时测定双黄连胶囊中黄芩苷、黄芩素的含量

徐占方 杨秀美 潘鹏飞

[摘要] 目的：建立反相高效液相色谱法同时测定双黄连胶囊中黄芩苷、黄芩素的含量。方法：采用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，检测波长为277 nm，流速为1.0 ml/min，进样量为10 μl，柱温为30℃。结果：黄芩苷在6.072～151.800 μg/ml范围内有良好的线性关系，r=1.000 0（n=7）；黄芩素在2.124～53.100 μg/ml范围内有良好的线性关系，r=0.999 4（n=7）。黄芩苷的平均回收率为99.21%，RSD为0.5%（n=6）；黄芩素的平均回收率为99.12%，RSD为0.6%（n=6）。结论：本法操作简便、快速、结果准确，可用于双黄连胶囊的质量控制。

[关键词] 含量测定；黄芩苷；黄芩素；高效液相色谱法

[中图分类号] R927.2 [文献标识码] A[文章编号]1673-7210（2011）11（c）-067-03

Simultaneous determination of contents of Baicalin and Baicalein in Shuanghuanglian Capsules by high performance liquid chromatography

XU Zhanfang1, YANG Xiumei2, PAN Pengfei1

1.Jixi Food and Drug Control and Detection Center in Heilongjiang Province, Jixi 158100, China; 2.Department of Nursing, Jiguan District Hospital in Jixi City, Heilongjiaing Province, Jixi 158100, China

[Abstract] Objective: To establish simultaneous determination of the contents of Baicalin and Baicalein in Shuanghuanglian Capsules by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods: With methanol-0.1% phosphoric acid solution as the mobile phase gradient elution, the Agilent Eclipse XDB-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) chromatographic column was used; the detection wavelength was 277 nm; the flow rate was 1.0 ml/min; the injection volume was 10 μl; the column temperature was 30℃. Results: The Baicalin showed a favorable linear relationship in the range of 6.072-151.800 μg/ml, r=1.000 0 (n=7), while the Baicalein showed a favorable linear relationship in the range of 2.124-53.100 μg/ml, r=0.999 4 (n=7). The average recovery rate of Baicalin was 99.21%, with the relative standard deviation (RSD) was 0.5% (n=6), while the average recovery rate of Baicalein was 99.12%, with the RSD was 0.6% (n=6). Conclusion: This method is simple, fast and accurate, therefore it can be used for the quality control of Shuanghuanglian capsules.

[Key words] Content determination; Baicalin; Baicalein; High performance liquid chromatography

双黄连胶囊由金银花、黄芩和连翘三味中药组成，具有辛凉解表、清热解毒之功效，可用于发热、咳嗽、咽痛等[1]。黄芩的主要成分有黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素[2]，双黄连胶囊中黄芩苷的HPLC法测定[3]已有报道，现行质量标准仅有黄芩中黄芩苷的定量检测，然而黄芩苷在内源酶催化水解作用下，产生大量的黄芩素[4]，仅以黄芩苷一个指标不能全面评价黄芩的质量。本文同时测定双黄连胶囊中黄芩苷、黄芩素2种主要成分的含量，结果表明，供试品在高效液相色谱中分离效果好，阴性样品溶液对测定无干扰，方法简单、准确、重复性好，可用于双黄连胶囊中黄芩的质量控制。

1 仪器与试药

HP1100高效液相色谱仪Agilent 1200LC工作站，METTLER TOLEDO电子天平AG285，KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器，SHIMADZU UV-2550紫外可见分光光度计；黄芩苷对照品（批号：110715-200815，含量为95.2%，中国药品生物制品检定所），黄芩素对照品（批号：111595-200604，中国药品生物制品检定所），双黄连胶囊（市售样品3批，批号：110101、091212、100701），其他试剂均为色谱纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，以甲醇（A）-0.1%磷酸酸溶液（B）为流动相梯度洗脱：40%A（0 min），80%A（40 min），40%A（60 min），检测波长为277 nm，流速为1.0 ml/min，进样量为10 μl，柱温为30℃。理论板数不低于10 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液制备精密称取样品适量，约0.24 g置100 ml容量瓶中，加70%乙醇80 ml，超声提取30 min，放置至室温，加70%乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密吸取2 ml置10 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，备用。

2.2.2 对照品溶液制备分别精密称取P2O5干燥过夜的黄芩苷、黄芩素对照品31.89 mg和10.62 mg，置同一50 ml容量

瓶中，加甲醇适量，超声使溶解，用甲醇稀释至刻度，滤过，精密吸取2 ml置20 ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度作为混合

对照品溶液。

2.2.3 空白溶液制备按双黄连胶囊的处方、制法不加黄芩粉末，制备阴性样品，按“2.2.1”项下方法制成空白对照溶液。

2.3 线性关系考察

取混合对照品贮备液摇匀，滤过，按上述色谱条件，分别进样1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μl，以峰面积Y对浓度X（μg/ml）进行线性回归，得黄芩苷回归方程为Y=31.87X-7.453，r=1.000 0（n=7），表明黄芩苷在6.072～151.800 μg/ml范围内线性关系良好；黄芩素回归方程为Y=48.27X+29.04，r=0.999 4（n=7），表明黄芩素在2.124～53.100 μg/ml范围内有良好的线性关系。

2.4 精密度试验

取对照品溶液（浓度为黄芩苷60.72 μg/ml，黄芩素21.24 μg/ml），重复进样5次，每次10 μl，测得黄芩苷峰面积值的RSD为0.2%（n=5），黄芩素峰面积值的RSD为0.6%（n=5），表明本方法精密度良好。

2.5 稳定性试验

精密称取样品适量，按“2.2.1”项下的方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、16、24 h，重复进样，每次10 μl，测得黄芩苷和黄芩素峰面积的RSD分别为0.7%和0.9%（n=7），表明样品在24 h内稳定。

2.6 重复性试验

分别精密称取同一供试品（批号：110101）5份，按“2.2.1”项下的方法制备供试品溶液，测量黄芩苷和黄芩素平均含量分别为76.04 mg/g和5.76 mg/g，RSD分别为0.9%和1.0%（n=5），表明本方法重复性较好。

2.7 回收率试验

精密称取已知含量的样品（批号：110101，平均装量为0.395 4 g）约0.12 g，共6份，分别置100 ml容量瓶中，超声30 min，放置室温，用70%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取2 ml置10 ml容量瓶中，分别精密加入对照品溶液：黄芩苷对照溶液（231.8 μg/ml）和黄芩素（17.48 μg/ml）各1.0、1.0、1.0、1.0、1.0、1.0 ml，加甲醇稀释至刻度，用微孔滤膜滤过，进样10 μl，结果黄芩苷平均回收率为99.21%，RSD为0.5%（n=6），黄芩素平均回收率为99.12%，RSD为0.6%（n=6）。见表1。

2.8 样品含量测定

取本品10片，精密称定，研细，按“2.2.1”项下的方法制备供试品溶液，每一批号的供试品平行制备3份。按上述色谱条件进样，按峰面积外标法测定含量。见表2。

3 讨论

3.1 测定波长的选择

文献[5]报道了检测波长为277 nm，本试验结果也表明在277 nm处黄芩苷和黄芩素分离效果好，能够满足试验要求，故将测定波长确定为277 nm。

3.2 色谱条件的考察

采用梯度洗脱，既能缩短分离时间，又能提高分离效果，采用150 mm短柱，黄芩素与相邻杂质峰分离不好，故选用250 mm的长柱，流动相分别先后考察了磷酸溶液-乙腈、磷酸溶液-甲醇的梯度洗脱，结果表明，采用磷酸溶液-甲醇的梯度洗脱分离效果好。

3.3 提取方法的考察

在实验过程中，先后采用了不同浓度的甲醇、不同浓度的乙醇超声30 min提取，结果表明70%乙醇超声30 min提取效率高，又比较了70%乙醇加热回流3 h提取与超声30 min的提取效果，结果表明，加热回流与超声提取无明显差异，最终选用70%乙醇超声30 min提取。

3.4 可用于定性鉴别

汉黄芩素也是黄芩的主要成分之一，本法也能实现汉黄芩素和杂质峰的有效分离，汉黄芩素的保留时间约为29 min。由于所收集的样品中汉黄芩素的含量低，测得的峰面积较小，未能实现定量检测，但可用于定性鉴别。

[参考文献]

[1]国家药典委员会.国家药品监督管理局药品标准(新药转正标准)[S].24册.2002:844.

[2]南京中医药大学.中药大辞典(下册)[M].2版.上海:上海科学技术出版社,2006:2806.

[3]王君耀,刘放.RP-HPLC测定双黄连胶囊中黄芩苷含量[J].中成药,2003,25(10):附3-4.

[4]李建华,王力生,邹节明.水提工艺中黄芩内源酶降解黄芩苷的研究[J].中草药,2009,40(3):397-400.

[5]陈立柱,赵怀清.HPLC法同时测定消炎片中黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量[J].沈阳药科大学学报,2011,28(6):448-452.

（收稿日期：2011-09-02）