单叶蔓荆种质资源遗传多态性的RAPD分析

孙维洋 李剑芳 邱进 徐凌川

[摘要] 目的：利用RAPD技术分析野生单叶蔓荆（Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham.）种质资源的遗传多态性及种内遗传差异。方法：本研究以7个不同产区的野生蔓荆为试材，采用RAPD技术对其遗传物质进行分析，结合NTSYS-2.10e软件进行遗传相似系数计算和UPGMA方法聚类分析。结果：10个随机引物共获得88条DNA谱带，其中46条（52.3%）具有多态性；采用CTAB法提取DNA时，先将试材在0.9%的蔗糖溶液中暗培养48 h，有利于提高DNA提取率和纯度。结论：各种质之间均存在一定的遗传差异，与地域关系和主要有效成分的化学差异并不一致，尚需进一步的植物逆境生理和功能基因组学研究来解释这一现象。

[关键词] 单叶蔓荆；遗传多样性；随机扩增多态性

[中图分类号] R949.95 [文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2011）11（c）-005-03

Analysis on genetic polymorphism in germplasm materials of Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham. by RAPD

SUN Weiyang, LI Jianfang, QIU Jin, XU Lingchuan

School of Pharmacy, Shandong University of TCM, Shandong Province, Ji'nan 250355, China

[Abstract] Objective: To study genetic polymorphism in germplasm materials of wild Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham. and species differences of the genetic by RAPD. Methods: 7 wild germplasms of Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham. from different areaes were analyzed in this study. RAPD was used to analyze the genetic material, and the NTSYS-2.10e software was used to calculate the genetic similarity coefficient, the UPGMA method was used to do the clustering analysis. Results: 88 DNA bands were amplified with 10 primers, 46 of which (52.3%) were polymorphic. Culturing the plant materials in 0.9% sucrose solution in darkness for 48 h before using the CTAB to extract DNA could greatly improve the yield and purity of DNA. Conclusion: There are certain genetic differences in all kinds of quality, which is not accordance to the regional relations and the chemical difference of major effective component. The reason of this phenomenon still needs to be further plant stress physical and functional genomics research to explain.

[Key words] Vitex trifolia L. var. simplicifolia Cham.; Genetic polymorphism; RAPD

单叶蔓荆（Vitex trifolia L.var. simplicifolia Cham.）的干燥成熟果实为我国传统中药材蔓荆子的来源之一，蔓荆子始载于《神农本草经》[1]，在我国已有2 000余年的栽培和药用历史，有疏散风热、清利头目之功效，用于治疗风热感冒、头痛、齿龈肿痛、目赤多泪、目暗不明、头晕目眩等[2]。单叶蔓荆主产于山东、江西等省，而蔓荆子的另外一种药源植物蔓荆（Vitex trifolia L.）则主要分布在广西等地。近年来，随着各地引种栽培活动的频繁以及规范化种植的需要，对蔓荆子种质资源遗传多样性的研究日益受到人们的关注。运用显微鉴别方法、薄层色谱和紫外吸收光谱法可以辨别蔓荆子及其混淆品牡荆子[3]，而利用扫描电镜法可以区分单叶蔓荆和蔓荆，但是种内的遗传多样性不明显[4]。1990年美国杜邦公司农产品研究中心的Williams等[5]第一次用随机排列的10碱基寡核苷酸作为单引物扩增寻找多态性DNA片段获得成功，他们称之为随机扩增多态性（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）技术。Nakai等[6]用RAPD技术对淫羊藿属8种植物进行了DNA分析，此后，应用RAPD技术对药材道地性的研究逐渐增多，RAPD技术以其快速、微量、特异性强、准确可靠且不受生育阶段、供试部位、环境条件、储藏因素等的影响，在中药分类、鉴定研究中展示了广阔的应用前景。本研究采用RAPD技术对7个不同产地的野生单叶蔓荆进行了遗传多样性分析。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

来源于不同居群的野生蔓荆于2009年8月份定植于山东中医药大学药圃内，分别编号为V1～V7，不同居群蔓荆的产地及生长环境，见表1。蔓荆株行距1 m×1.2 m，于2010年7月份每居群选取1株，每株剪取15 cm左右长度的新梢3支，于浓度0.9%的蔗糖水溶液中暗培养48 h，取叶片以去离子水洗净，拭干。

1.2 仪器与试剂

Eppendorf Mastercycler gradient PCR仪；Universal HoodⅡ型紫外凝胶成像系统；RAPD随机引物（购于济南博亚生物技术有限公司，长度为10 bp）。

2 方法与结果

2.1 总DNA的提取

DNA提取参照CTAB法[7]，各样品取少量叶片（约0.1 g），置于1.5 ml离心管中，液氮充分冷冻，用预冷的塑料研杵迅速充分研磨至粉状。每管加入800 μl的2% CTAB抽提缓冲液[0.1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）、0.02 mol/L EDTA（pH 8.0）、1.5 mol/L NaCl（pH 8.0）、2%CTAB（W/V）]，轻轻摇动混匀，置于60℃水浴中，约10 min摇动1次，30 min后取出；冷却2 min后，加入氯仿至满管，剧烈震荡3 min，轻轻颠倒混匀；12 000 r/min离心5 min，上清转至装有800 μl预冷异丙醇的EP管中，轻轻颠倒混匀，静置5 min。吸出上清，沉淀用70%乙醇洗涤2次，吹干，用50 μl 0.5×TE缓冲液（含Rnase）溶解，37℃放置15 min，BioPhotometer Plus核酸蛋白测定仪测定DNA样品浓度，-20℃保存备用。

2.2 随机引物的筛选

按照各模板DNA的浓度计算所取体积，最终配置该含有等浓度7种DNA样品的混合样品（Pool），对160个随机引物进行筛选，得到10个条带较多且清晰、多态性较好的引物。见表2。

2.3 扩增

RAPD-PCR反应体积为25 μl，其中包括1×buffer、2.5 mmol/L MgCl2、100 μmol/L dNTP、0.2 μmol/L引物、1 U Taq酶及30 ng模板DNA。扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃预变性30 s，40℃预变性60 s，72℃预变性90 s，40个循环；72℃预变性5 min；4℃保存。

2.4 RAPD扩增产物检测

从上述10个条带中随机选取两个引物进行PAPD扩增产物检测，即P20和P27。取5 μl扩增产物加1 μl上述缓冲液，混匀，于含0.05%溴化乙锭的0.7%的琼脂糖凝胶上电泳检测，电极缓冲液为0.5×TBE，电压为5 V/cm，Maker 2 000为参照，用紫外凝胶成像系统拍照，电泳结果见图1。

2.5 数据记录与统计

RAPD为显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为具有同源性。将PCR扩增的DNA电泳条带作为位点记录下来，若某个扩增条带在一个样品中出现，记作“1”，未出现的记作“0”。原始数据的整理采用Excel软件，利用NTSYS-2.10e软件进行遗传相似系数计算和UPGMA方法聚类分析，结果分别见表3和图2。

3 讨论

3.1 蔓荆基因组DNA的提取

在提取DNA之前，新梢和叶片在0.9%的蔗糖水溶液中暗培养48 h可以降低淀粉、色素等干扰物质对DNA提取的干扰。本研究采用CTAB小量法提取DNA，所得基因组DNA的提取率和纯度都比较高，对DNA样品进行RAPD扩增分析，结果表明，这些DNA样品均可以扩增出谱带，且扩增带型清晰度较高，有效地排除了叶绿素及次生代谢产物对PCR扩增结果的影响。另外模板中残留的氯仿、异丙醇等小分子有机物会影响Taq酶活性，为了得到纯度较高、有保证的扩增结果，最好用70%乙醇抽提2～3次，然后以含Rnase的TE缓冲液溶解，排除样品中少量RNA的影响。因为提取过程中各重复结果之间也会出现一定的差别，所以在使用之前每管所得DNA模板都必须在测定浓度之后，根据浓度确定PCR所需模板DNA溶液的体积，否则可能会导致条带不清晰、假阳性等异常结果。

3.2 各产地野生蔓荆RAPD标记遗传多样性

本实验利用RAPD分子标记对我国蔓荆子主要产地山东、江西、安徽等7个地区的野生蔓荆进行了遗传多态性分析，从160条RAPD引物中筛选出扩增条带清晰、重复性高的引物10条（表1）。RAPD扩增的条带在250～2 500 bp之间，10条引物共扩增出88条带，多态性条带为46条，多态性比率为52.3％。

由聚类分析（图2）可见，各种质之间均存在一定的遗传差异，7个样本大致可以分为4组，在相似系数0.84的水平上V3和V5聚为一组，V6和V7聚为一组，而在0.80的水平上V1和V2聚为一组，V4单独一组。说明V3和V5、V6和V7相似系数较高，V1和V2次之，另外，V1、V2、V3、V5之间的遗传相似性较强，而它们与V4、V6、V7的遗传关系较远。这种遗传关系可能是在人工引种的基础上[8]，由长期的自然变异导致的，尚需进一步的考证。

3.3 小结

根据吴永忠等[9]的报道，其测定的样品中山东牟平姜格庄、江西星子蓼花和江西都昌多宝与本研究所采样品在地域分布上相距较近，可以认为是来自相同产区的样品；研究发现，江西两地所产蔓荆子药材中蔓荆子黄素含量为0.218 9%和0.197 6%，是山东牟平所产蔓荆子含量（0.074 3%）的2~3倍。而本研究结果显示，V2（山东牟平）与V5（江西多宝）之间的遗传相似性要高于V5与V6（江西都昌）之间的遗传相似性，是什么因素导致了蔓荆子化学多样性与其种质的遗传多态性之间的差异呢？初步判断可能由以下原因造成：第一，RAPD分析的遗传多态性并不一定能够体现相关化学成分合成途径中关键基因的表达差异，本实验数据显示，各种质之间均具有一定程度的遗传差异，但所有的种质之间的最大遗传差异为0.307（表3中V7与V2、V4的交叉处），这充分说明对于蔓荆而言种内的遗传关系总体来说是较近的，而少量遗传物质的差异是否直接与相关化学成分的合成有关还不得而知；第二，环境因素对相关化合物含量的影响可能大于遗传距离的影响，干旱、盐碱等胁迫条件是否促进了植物的逆境应答，在应答机制里面相关成分是否起到了重要作用。以上研究都与植物逆境生理及植物功能基因组学有着密切的关系，这些问题的解答必将促进药用植物化学多样性与遗传多态性的关系研究，同时为药材资源的整理、创新以及规范化栽培提供科学参考。

[参考文献]

[1]曹元宇.神农本草经[M].上海:上海科学技术出版社,1987:220.

[2]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:340-341.

[3]陆大忠,朱山寅.蔓荆子与混淆品牡荆子的比较鉴别[J].中药材,1999,22(4):179-181.

[4]靳光乾,郭庆梅,刘善新,等.不同产区蔓荆子扫描电镜观察[J].中国中医药信息杂志,2007,14(10):34-35.

[5]Williams J G K, Kubelik A R, Kenneth J L, et al. DNA polymorphism samplified by arbitrary primers are useful as genetic markers [J]. Nucleic Acids Res,1990,18(22):6531-6535.

[6] Nakai R, Shayama Y, Shirashi S, et al. Genetic characterization of Epimedium species using random amplified polymorphic DNA (RA PD) and PCR restriction fragment length polymorphism (RFLP) diagnosis [J]. Biol Pharm Bull,1996,19:67-71.

[7]顾红雅,瞿礼嘉.植物分子生物学实验手册[M].北京:高等教育出版社,1998:7.

[8]靳光乾,张卉,刘善新,等.不同产地蔓荆子种子质量研究[J].种子,2007,26(4):66-68.

[9]吴永忠,朱良辉,肖明,等.不同产地蔓荆子化学成分含量比较[J].中药材,2000,23(10):616-619.

（收稿日期：2011-06-16）

[基金项目] 山东省教育厅项目（项目编号：J08LG19）。

[作者简介] 孙维洋（1974-），山东昌邑人，副教授；研究方向：分子生药学。