HAART联合康爱保生浓缩丸对HIV病毒载量被有效抑制后的HIV/AIDS患者的NK细胞的干预作用*

温 敏， 李艳萍， 何 鹏， 赵 远

(1.成都中医药大学，四川 成都 611137； 2.云南省中医中药研究院， 云南 昆明 650223；3.云南省腾冲县人民医院， 云南 腾冲 679100)

目前艾滋病流行态势依然严峻，截至2011年底，估计中国存活HIV感染者和AIDS患者(PLHIV)78万人，其中艾滋病(AIDS)患者15.4万人，云南省是中国艾滋病流行最严重的地区之一[1]。HAART是艾滋病治疗的主要手段，能显著降艾滋病患者的HIV病毒载量和增加CD4+T细胞数量[2～3]，临床实践表明中医药在改善艾滋病患者的临床症状和改善患者生存质量方面效果明确。那么在HAART联合中药对HIV病毒载量被有效抑制的HIV/AIDS患者的NK细胞的变化趋势有何干预作用？因此本文将通过临床随机双盲试验研究，观察HAART联合中药对HIV-1病毒载量被有效抑制后的NK细胞的动态变化，初步阐释HAART联合中药治疗HIV/AIDS的优势和可能作用靶点。

1 资料与方法

1.1 临床资料 126名HIV/AIDS患者来自云南省腾冲、祥云县人民医院国家免费艾滋病抗病毒治疗时间至少6个月以上，进行HAART联合康爱保生浓缩丸治疗前HIV-1病毒载量均低于检测限(50拷贝/mL)。遵循临床随机双盲试验原则将126名符合入组条件的HIV/AIDS患者分为HAART+中药(康爱保生浓缩丸)组和HAART+中药组。

1.2 试验用药物 HAART药物为国家免费艾滋病抗病毒药物。中药为康爱保生丸浓缩丸，系云南省中医中药研究院附属医院制剂，并用于云南省中医药治疗艾滋病试点项目的中药院内制剂(批准文号为滇药制字Z20090006A)。该剂处方由紫花地丁、黄芩、桑白皮、人参组成。具有解毒清热，活血祛湿，养阴益气等功效。服用方法：6 g/次，1日4次，有效期36个月。由云南省中医中药研究院提供。

1.3 随访时间 2010年4月～2011年5月，在临床随机双盲试验的0、3、6、9、12月进行随访，检测NK细胞。

1.4 NK细胞计数 用FC500流式细胞分析仪进行荧光抗体标记检测。所用单克隆抗体及其组合为：CD3/CD16±56/。加入20 μL试剂和100 μL Flow-Count 荧光微球至管底，加入100 μL混合均匀的受试对象抗凝全血至管底，轻柔振荡混匀后室温避光孵育15 min，加入450 μL FACS Lysing solution溶解红细胞，室温溶血6～12 min。1700 r/min离心5 min，倒掉上清，用1%小牛血清洗液2 mL洗涤，1700 r/min离心5 min后，倒掉上清，加入600 μL 1%多聚甲醛固定液，上机检测。

1.5 统计学方法 用SPSS 15.0软件包处理所有的数据，CD4+T细胞基线、CD8+T细胞基线、入组时年龄、HAART持续时间、NK细胞绝对计数用中位数(四分卫数)表示。分组比较用Mann-Whitney U检验。双侧有显著性差异(P<0.05)。

2 结果

2.1 入组HIV/AIDS患者一般人口学资料 126例HIV-1AIDS的一般人口学资料见表1。按照入组时随机双盲原则进行分组，分别给予HAART联合中药(康爱保生浓缩丸)、HAART+安慰剂两种不同干预措施，两组各因素的差异没有显著性意义(P>0.05)，见表1。

表1 126例AIDS患者分组的一般人口学资料

2.2 HAART联合康爱保生浓缩丸对NK细胞的干预作用 在0月时HAART+康爱保生浓缩丸组和HAART+安慰剂组的NK细胞相对计数的差异有显著性意义(P=0.012)，经过12月的治疗，两组在各随访点的NK细胞绝对计数总体逐渐增长，从第9个月开始HAART+中药组的NK细胞绝对计数大于HAART+安慰剂组，在12月时两组的NK细胞绝对计数细胞的差异有显著性意义(P=0.032)，结果见表2。

表2 HAART联合康爱保生浓缩丸对HIV-1病毒载量有效抑制下的NK细胞的干预作用研究

注：2组比较，*P<0.05

根据入组时CD4+T细胞数量将HAART+康爱保生浓缩丸组和HAART+安慰剂组分为CD4+T细胞基线<200个/μL和CD4+T细胞基线≥200个/μL两层进行统计分析。

CD4+T细胞基线≥200个/μL层：在各随访时间点HAART+安慰剂组和HAART+康爱保生浓缩丸组的NK细胞绝对计数分别为：0月，194个/μL(128～320个/μL)，173个/μL(118～282个/μL)；3月，163个/μL(125～265个/μL)，210个/μL(174～328个/μL)；6月，214个/μL(130～409个/μL)，234个/μL(154～380个/μL)；9月，335个/μL(203～424个/μL)，292个/μL(218～367个/μL)；12月，385个/μL(266～704个/μL)，475(266～574个/μL)。

CD4+T细胞基线<200个/μL层：在各随访时间点HAART+安慰剂组和HAART+康爱保生浓缩丸组的NK细胞绝对计数分别为：0月，157个/μL(106～210个/μL)，138个/μL(94～309)个/μL；3月，163个/μL(125～265个/μL)，210个/μL(174～328个/μL)；6月，172个/μL(122～437个/μL)，214个/μL(130～409个/μL)；9月，250个/μL(180～384个/μL)，292个/μL(200～345个/μL)；12月，372个/μL(189～574个/μL)，469个/μL(230～604个/μL)。结果显示入组CD4+T细胞基线<200个/μL的HIV/AIDS患者在12个月的随访过程中HAART联合康爱保生浓缩丸组的NK细胞绝对计数增长趋势比HAART+安慰剂组的明显(图1)。

图1 入组CD4+T细胞基线<200个/μL层的HAART联合中药和HAART+安慰剂组的CD4+T细胞变化趋势

3 讨论

从2004年全国开始实行中医药治疗艾滋病试点项目以来，对全国9000多例临床资料总结可以明确中医药可以明显减轻发热、乏力、气短、咳嗽、腹泻、皮疹等症状，增加患者体重，恢复部分患者的劳动能力，提高患者的生存质量。但中医药治疗HIV/AIDS研究仍有局限性，主要体现在(1)中医药治疗HIV/AIDS效果缓慢、效果不稳定；(2)中医药治疗HIV/AIDS靶点不明确，对其作用机制的研究较少。那么中医药除改善临床症状外介入艾滋病治疗的切入点何在，有何优势？HAART联合中药是否对NK细胞有干预作用？

NK细胞(natural killer cell，自然杀伤细胞)是天然免疫系统中一个重要的组成部分，是一类来源于骨髓的大颗粒淋巴细胞，在正常外周血中大约占单个核细胞成分的10%～15%，是免疫防御的第一道防线，NK细胞在抗病毒、抗肿瘤中发挥着极其重要的作用[4]。NK细胞分为三个亚群，即：CD56dimCD16+、CD56briCD16+/-和CD56-CD16+NK细胞。CD56dimCD16+NK细胞占外周血NK细胞的80～90%，通过与细胞直接结合或者通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应发挥细胞杀伤功能；CD56briCD16+/-NK细胞占外周血NK细胞的2～10%，主要通过分泌IFN-γ、TNF、IL-2等细胞因子发挥免疫调节功能；CD56-CD16+NK细胞的比例不足10%，是一群具有较低杀伤能力的未成熟的NK细胞[5]。国内外研究表明HIV感染者和发病者的具有细胞毒活性的CD56dimCD16+细胞百分比明显低于HIV抗体阴性健康对照，而杀伤功能较弱的CD56-CD16+NK细胞百分比明显高于HIV抗体阴性[6～7]。

我国学者对HAART持续超过1年的HIV/AIDS患者的NK细胞亚群研究发现HAART对NK细胞亚群构成的恢复有一定作用，特别是发挥主要功能的CD56dimCD16+细胞亚群的恢复[7]。笔者研究发现经过12个月的治疗HAART联合康爱保生浓缩丸对HIV病毒载量被有效抑制至检测限下的HIV/AIDS患者的NK细胞绝对计数和HAART+安慰剂的差异有显著性差异(P<0.05)。根据随机双盲试验入组时CD4+T细胞基线分层统计后发现入组时CD4+T细胞基线<200个/μL层的HIV/AIDS患者HAART联合康爱保生浓缩丸组在12个月的随访过程中NK细胞绝对计数的增长趋势好于HAART+安慰机组的。结果提示HAART联合康爱保生浓缩丸可能提高HIV/AIDS患者的NK细胞绝对计数，提高NK细胞数量可能是HAART联合中药或中药治疗艾滋病临床有效的一个作用靶点，同时也是HAART持续治疗过程中中药介入艾滋病治疗的一个切入点和优势。HAART联合中药或中药对NK细胞的作用需进一步通过规范的随机双盲试验和扩大病例数、延长观察时间进一步确定。同时应考察HAART、HAART联合中药或中药不同治疗措施对NK细胞的三个亚群：CD56dimCD16+、CD56briCD16+/-和CD56-CD16+NK细胞的干预作用，从而发现不同治疗措施下NK细胞亚群的变化趋势，为发挥不同治疗措施的优势和特点提供科学依据。

[1]中国人民共和国卫生部，联合国艾滋病规划署，世界卫生组织2011年中国艾滋病评估报告[EB/OL].http：//www.moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohjbyfkzj/s3586/201201/53957.htm.

[2]Torre D，Speranza F，Martegani R．Impact of highly active antiretroviral therapy[J]HIV Med，2005，6(2)：66～78.

[3]Wensing A，VijverDvd，Asjo B，et al．Prevalence of transmitted drug resistance in Europe is largely influenced by the presence of non-B sequences：analysis of 1400 patients from 16 countries：the CATCH-Study[J].Anti vir Ther，2003，8(suppl1)：S131．.

[4]Papamiehail M，Perez SA，Gritzapis AD，et al.Natural killer lymphoeytes：biology，development，and function[J].Cancer Immunol Immunother.2004；53(3)：176～186.

[5]Cooper MA，Fehnige TA，Turner SC，et al.Human natural killer cells：a unique innate immunoregulatory role for theCD56 bright subset[J].Blood.2001，97(10)：3146～3151.

[6]Alter G，Teigen N，Davis BT，et al.Sequential deregulation of NK cell subset distribution and function starting in acute HIV-1 infection[J].Blood，2005，106(10)：3366～3369.

[7]陈欢，何磊，张子宁，等.HIV 感染者、发病者及 HAART 治疗者 NK 细胞亚群变化研究[J].免疫学杂志，2010，26(7)：557～560.