纸色谱-分光光度法测定生物转化体系中脱氧腺苷含量

刘国生，王建琨，邢善涛，王海磊，陈 琳，王玉娟

(1.河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007;2.新乡拓新生化科技有限公司，河南 新乡453000)

纸色谱-分光光度法测定生物转化体系中脱氧腺苷含量

刘国生1，王建琨1，邢善涛2，王海磊1，陈 琳1，王玉娟1

(1.河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007;2.新乡拓新生化科技有限公司，河南 新乡453000)

目的 建立纸色谱-分光光度法测定生物转化液中脱氧腺苷(dAR)含量。方法 用不同极性的展开剂进行纸色谱从混合物中分离dAR，分光光度法测定分离的dAR浓度。结果 测试了4种展开剂对dAR的分离效果，发现用展开剂正丁醇-异丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)一次色谱可将dAR与其它成分分离。将分离并重新溶解的dAR在258 nm处测定其吸光度值，根据标准曲线即可计算出转化反应液中的产物浓度。结论 该法测定结果与高效液相色谱法测定结果一致，是一种简易有效的快速测定生物转化体系中dAR含量的方法。

脱氧腺苷;生物转化;纸色谱;展开剂;分光光度法

核苷类化合物是开发合成新型抗病毒、抗肿瘤药物的一类重要原料，目前有近50%的抗病毒药物属于核苷类药物，如阿昔洛韦、阿糖腺苷、利巴韦林等［1］;许多抗肿瘤药物也属于核苷类药物，如阿糖胞苷、去氧氟尿苷等。这些药物可通过化学或生物方法合成［2-3］。本实验室利用产生核苷磷酸化酶［4-5］的微生物将底物脱氧胸苷(dTR)转化为脱氧腺苷(dAR)，以作为合成其它药物的中间体［6-7］。转化体系中有两种底物和两种产物，建立对产物进行快速定性和定量分析方法是优化反应条件和反应体系的基础。测定dAR的方法可采用高效液相色谱法(HPLC)、分光光度法和纸色谱法［8-13］。HPLC样品需要量小、结果精确，但常常会受到仪器条件制约;纸色谱简便，适合于混合样品的分离，但不能直接进行定量分析;分光光度法快速、简单，但不适合于该类混合样品的测定。本文将纸色谱与分光光度法结合起来，建立了定量测定转化体系中dAR的快速方法。

1 材料

dAR、dTR、胸腺嘧啶(T)、腺嘌呤(Ade)，均为分析纯生化试剂;氨水，冰醋酸，异丙醇，正丁醇，盐酸等均为分析纯。

752紫外光栅分光光度计，上海精密科学仪器有限公司;BS110型电子天平，北京赛多利斯仪器系统有限公司;ZF-8型三用紫外分析仪，上海康华生化仪器制造有限公司;Eppendorf Centrifuge 5804 R冷冻离心机。

2 方法与结果

2.1 纸色谱过程及其条件选择

2.1.1 纸色谱方法 分别配制浓度为30 mmol/L的dAR、dTR、T、Ade溶液。将新华一号滤纸裁制成20 cm×20 cm规格备用。各取对照品溶液及混合溶液2.0μL点样于新华一号滤纸，用不同成份的展开剂展开，取出滤纸40℃烘干后在254 nm波长下观察，画出各个紫色斑点，测量迁移距离，计算迁移率(Rf)。

2.1.2 正丁醇-冰乙酸展开剂系统分离dAR 首先以不同比例的正丁醇、冰乙酸、水作为展开剂，将各对照品及混合对照品点样后展开，观察各对照品展开后的Rf值及斑点情况。结果表明混合对照品色谱后形成2个斑点，其中dAR和Ade总是在一个色谱斑点内无法分开，dTR和T在另一个色谱斑点无法分开。说明采用该展开剂能将四种成分按嘌呤类和嘧啶类分开，但碱基与带有相应碱基的脱氧核苷不能有效分开。当用正丁醇-冰乙酸-水(6∶1∶3)为展开剂时，嘌呤类与嘧啶类成分的分离效果较好，此时 dAR、dTR、Ade 和 T 的 Rf值分别为 0.77，0.84，0.77 和 0.84。

2.1.3 异丙醇-氨水展开剂系统分离dAR 以不同比例的异丙醇、氨水、水为展开剂，纸色谱后观察各对照品展开后的Rf值及斑点情况。结果发现Ade很容易与其它三种成分分开，但其它三种成分却不能完全分开。当用异丙醇-氨水-水(7∶2∶1)展开时，嘌呤类与其它3种成分的分离效果最好，dAR、dTR、Ade 和 T 的 Rf值分别为0.83，0.85，0.65 和0.82。

2.1.4 双向纸色谱分离dAR 在dAR生物合成反应中，重点是将产物分离并进行定量测定。根据上述实验结果，采用正丁醇-冰乙酸展开剂可将dAR、Ade与dAR、T分开，而采用异丙醇-氨水展开剂可将Ade与其它成分分开，如果进行双向纸色谱［11］，就可能将dAR与其它各成分分开。因此实验首先用正丁醇-冰乙酸对混合样品进行分离，然后将滤纸烘干后在展开剂异丙醇-氨水中进行第二向色谱，结果dAR与其它三种成分得到了良好的分离。经双向纸色谱分离的dAR样点可进一步用分光光度法进行定量测定。

2.1.5 正丁醇-异丙醇展开剂系统分离dAR 虽然采用双向纸色谱可以将dAR与其它三种成分分离，但由于要进行二次色谱，所用时间就较长，这不利于转化反应过程对样品的大量分析工作。如果根据上述两种展开剂的极性特点，调整展开剂成分，则有可能采用一个展开剂就可将dAR与其它三种成分分开。我们将展开剂中非极性部分调整为正丁醇与异丙醇，极性成分使用冰乙酸或氨水，考察其对四种成分的分离情况。

以正丁醇-异丙醇-冰乙酸为展开剂，经过不同的配比色谱试验，结果显示该展开剂对四种成分的分离效果均不理想(图1A)，目标产物与其它成分不能有效分离，其中正丁醇-异丙醇-冰乙酸-水(3∶3∶2∶2)为展开剂时，dAR、dTR、Ade 和 T 的 Rf值分别为0.83，0.87，0.83 和 0.87。以正丁醇-异丙醇-氨水为展开剂对混合样品进行纸色谱，四种样品混合样经过色谱出现三个色谱斑点(图1B)，其中dAR单独为一个斑点，Rf值最大，位置在最前方;dTR和T在一个斑色谱点中，二者不能完全分开;Ade单独成一个斑点，Rf值最小，位置在最后面。虽然在此系统中dAR与T仍不能有效分开，但是作为目的产物的dTR或作为底物之一的Ade都得到了良好的分离效果，因此可对转化实验成功进行定性鉴定，也可为为产物浓度或底物浓度变化进行定量分析奠定基础。实验表明，正丁醇-异丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)为展开剂时的分离效果最好，此时dAR、dTR、Ade和 T 的 Rf值分别为 0.80，0.72，0.62 和 0.72，故在后续实验中采用此比例的展开剂对转化体系中的dAR进行纸色谱分离。

图1 正丁醇-异丙醇-冰醋酸、正丁醇-异丙醇-氨水纸色谱对4种化合物的分离结果Fig.1 The separated result of four compounds obtained by the paper chromatography method with chromatographic solution nbutanol-isopropyl alcohol-glacial acetic acid and n-butanol-isopropyl alcohol-ammonia

2.2 纸色谱-分光光度法方法学试验

2.2.1 dAR标准曲线的绘制 将10～60 mmol/L dAR对照品溶液各2.0μL点样于新华一号滤纸，用正丁醇-异丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)展开。待展开剂上行至距滤纸顶端2.0 cm左右时，取出，40℃烘干后，在254 nm波长下观察，画出紫色斑点，剪下斑点于5 mL离心管中，加水3 mL浸泡一定时间，在258 nm波长处测定吸光度(A)值，绘制dAR标准曲线，进行线性拟合，得到的线性回归方程为:C=101.01 A －3.72，r=0.999 7。

2.2.2 纸色谱-分光光度测定dAR含量的重复性试验 将含有30 mmol/L dAR的四种对照品混合液定量点样后，以展开剂正丁醇-异丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)进行纸色谱，将色谱的dAR样品点剪下，水浸泡后测定258 nm波长处的A值，由标准曲线方程计算dAR浓度。5次重复测定结果的RSD为0.34%。

2.3 纸色谱-分光光度测定转化反应液中dAR含量

2.3.1 菌种培养及转化反应 本试验筛选的转化合成dAR菌株，试管斜面保存。斜面培养基为酵母膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，水 1 000 mL，琼脂2.0%，pH 7.0 ～7.5。产酶培养基为牛肉膏10 g，酵母膏15 g，蛋白胨5 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，pH 7.0。

在500 mL锥形瓶加入产酶培养基120 mL，灭菌，从斜面上挑取菌体一环，37℃下摇床培养，转速为180 r/min，培养20 h，4℃，5 000 r/min离心10 min，得菌体，－20℃下冷冻备用。

在磷酸盐缓冲液中添加dTR、Ade和转化用的菌体细胞，搅拌反应5 h后取样分析。

2.3.2 转化反应液中dAR分光光度测定 在测定转化体系中dAR时，需将转化体系取1 mL，4℃，10 000 r/min 离心1 min，取上清液，点样2.0 μL，并点样四种对照品混合溶液，展开后，烘干、画出与dAR对照品斑点位置一致的紫色斑点，剪下，用水3 mL浸泡120 min，测定A值，根据dAR标准曲线算出其含量。表1为一次温度条件转化实验的测定结果，转化率以Ade为标准进行计算。

表1 纸色谱-分光光度法测定转化反应实验结果Tab.1 The deoxyadenosine content in biotransformation system measured by paper chromatography-spectrophotometry method

2.3.3 转化反应液中dAR回收率测定 取dAR转化体系转化液，4℃，10 000 r/min离心1 min，取上清液，用HPLC法精确测定dAR含量［14］，然后精确稀释至20 mmol/L的浓度。用纸色谱-分光光度法测定dAR含量。纸色谱点样时分别点5个样点，点样量为2.0μL，待样点干后再分别覆盖点样0，10，20，30，40 mmol/L dAR 对照品各 2.0 μL，然后用正丁醇-异丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)进行色谱分离、分光光度测定，计算dAR浓度及其回收率(表2)。平均回收率为99.4%，RSD为0.99%。表明采用展开剂正丁醇-异丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)分离转化液各成分，dAR得到良好分离，与对照品混合物色谱分离效果相同;分光光测定转化液中dAR的浓度与HPLC法一致，试验重复性良好，回收率可达99%以上。

表2 转化液中dAR含量测定及回收率试验Tab.2 The measuring results of deoxyadenosine content and recovery in biotransformation system

3 讨论

用正丁醇-冰乙酸-水(6∶1∶3)、异丙醇-氨水-水(7∶2∶1)分别作为单向纸色谱的展开剂，均不能实现将目标物dAR与其它成分分开，但先后用两种展开剂进行双向纸色谱可将dAR与其它碱基和核苷成分有效分离开，以此为基础结合紫外分光光度法即可实现对转化过程dAR产物的定量。该测定方法虽然简单，但一个样品要进行2次纸色谱，所用时间增加了一倍，这显然对于转化实验的分析测定不利。为了简化双向色谱为一次色谱，调整上述两种展开剂的极性与非极性成分及比例，结果其中以正丁醇-异丙醇-氨水-水(3∶3∶2∶2)为展开剂，可以一次色谱将dAR、Ade分别与其它成分分离，进一步用分光光度法测定分离的dAR量，即可计算出转化体系中的dAR浓度。该测定结果可靠，与HPLC法一致，且重复性好，回收率高，更重要的是时间测定缩短了一半。在没有高效液相色谱仪的条件下，该方法是一种操作简易、准确性好、成本较低的快速定性和定量的分析方法。此外，与HPLC相比，该方法的优点是可在一张滤纸上分离10～20个样品，可同时进行多个纸色谱分离，由于分光光度测定用时很少，因此纸色谱-分光光度法每测定一个样品的时间实际比HPLC法短。纸色谱-分光光度测定dAR方法的建立，可以满足dAR转化条件实验、菌种筛选、产品检测等大量定量测定工作的需要，对dAR的研究与开发具有重要意义。

［1］张绍谭，倪孟祥，阮期平.核苷类药物的酶法合成［J］.药学进展，2005，29(2):56-62.

［2］邱蔚然，丁庆豹.酶法合成核苷类抗病毒药物［J］.中国医药工业杂志，1999，30(10):474-479.

［3］汤雁波，李卓荣.核苷类抗病毒药物研究进展［J］.中国生化药物杂志，2004，25(1):88-90.

［4］魏晓琨，王昌禄，张春艳，等.产气肠杆菌菌体内核苷磷酸化酶酶活测定条件的分析［J］.中国临床医药研究杂志，2007，175:4-7.

［5］刘国生，邢善涛，王建琨，等.埃希菌全细胞转化阿糖尿苷合成阿糖腺苷［J］.中国医药工业杂志，2010，41(6):416-419.

［6］洪云海，丁庆豹，欧 伶，等.应用乙酰短杆菌酶法合成2'-脱氧腺苷［J］.工业微生物，2006，36(1):30-33.

［7］Kenzo Yokozeki，Takashi Tsuji.A novel enzymatic method for the production of purine-2'-deoxyribonucleosides［J］.J Mol Catal B:Enzymatic，2000，10(1-3):207-213.

［8］卢 发，张伟国.纸色谱-分光光度法测定发酵液中 L-丝氨酸和甘氨酸的含量［J］.分析与检测，2005，31(3):119-121.

［9］王 薇，立 周，辛志豪，等.纸色谱-分光光度法测定发酵液中L-丝氨酸的含量［J］.江苏食品与发酵，2008，132(1):7-10.

［10］陈 武，龚美义.纸色谱-分光光度法测定腺苷的含量［J］.广东化工，2010，37(6):263-264.

［11］李 睿，何庆元，王 玉.更昔洛韦吸收系数测定的不确定度分析［J］.中国生化药物杂志，2005，26(5):294-296.

［12］刘志祥，王国华，姜素萍.纸色谱-分光光度法测定肌苷制剂的含量［J］.现代应用药学，1994，11(3):31-32.

［13］彭义交，刘宗林.大豆异黄酮双向纸色谱分析方法的研究［J］.食品科学2004，25(4):141-144.

［14］陈 博，金 瓯.冬虫夏草及其虫草菌粉中核苷类成分的HPLC 测定［J］.中国生化药物杂志，1998，19(2):88-90.

Determination of deoxyadenosine in biotransformation system by paper chromatography-spectrophotometry

LIU Guo-sheng1，WANG Jian-kun1，XING Shan-tao2，WANG Hai-lei1，CHEN Lin1，WANG Yu-juan1
(1.School of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007，China;2.Xinxiang Tuoxin Biochemical Technology ＆ Science Co.，Ltd.，Xinxiang 453000，China)

Purpose To establish a paper chromatography-spectrophotometry method for the determination of deoxyadenosine content quickly and easily in biotransrormation system.Methods The deoxyadenosine product was separated from mixture by means of the paper chromatography method with different polarity chromatographic solutions，and the concentration of separated deoxyadenosine was measured with spectrophotometer.Results The separation effect of 4 kinds chromatographic solutions were tested.The separation of deoxyadenosine could be achieved effectively，when solution n-butanol-isopropyl alcohol-ammonia solution-water(3∶3∶2∶2)was used as solvent to do single-dimensional paper chromatography.The separated deoxyadenosine was re-dissolved，and its absorption value was measured at 258 nm.The concentration of deoxyadenosine in biotransformation liquid could be calculated according to th e absorption valueand standard curve.Conclusion The determining results by of paper chromatography-spectrophotometry method was the same as that by HPLC method.This method was simple and effective with a good reproducibility for the determination of deoxyadenosine product in biotransrormation system.

deoxyadenosine;biotransformation;paper chromatography;chromatographic solution;spectrophotometry

TQ460.7;R927.2

A

1005-1678(2012)02-0132-04

2010-12-06

国家科技部科技人员服务企业行动项目(2009GJD00044);河南省教育厅自然科学基金项目(2008A180018)

刘国生，男，博士，教授，从事工业微生物研究，E-mail:hnliugs@163.com。