高效液相色谱串联质谱法测定猪肉中磺胺多辛的不确定度评定

张厚森* 武晓静 王 玮 方文娟

（江苏省理化测试中心，江苏省营养成分与有毒有害物质检测中心，南京 210042）

高效液相色谱串联质谱法测定猪肉中磺胺多辛的不确定度评定

张厚森* 武晓静 王 玮 方文娟

（江苏省理化测试中心，江苏省营养成分与有毒有害物质检测中心，南京 210042）

对高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中磺胺多辛含量过程中引入的不确定度进行了分析和评定，通过试验计算出猪肉中磺胺多辛含量测量结果的不确定度。在置信水平为95%，包含因子k=2时，其相对扩展不确定度8.58%；当磺胺多辛含量为35.37 μg/kg，其扩展不确定度为3.03 μg/kg。样品的前处理所引入的不确定度对合成不确定度的贡献最大。

不确定度；液相色谱串联质谱；磺胺多辛；猪肉

磺胺多辛（Sulfadoxine） 又名周效磺胺，磺胺邻二甲氧嘧啶，是一种应用较广的磺胺类药物（Sulfonamides，SAs）。磺胺多辛属长效磺胺类药物，具广谱抗菌作用，作为一种化学抗菌消炎药物其主要用于预防和治疗细菌感染性疾病。磺胺多辛对畜禽疾病控制和治疗起到重要作用，但是磺胺类药物存在着严重的副作用，人体中长期存在磺胺类药物会导致许多细菌对其产生耐药性，且具有潜在的致癌性。当前，国家逐渐加大了对畜禽产品中兽药残留的监管力度，我国农业部第235号文件规定在动物源性食品中磺胺类药物的总残留限量为100 μg/kg。

目前液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS） 已经广泛应用于磺胺类兽药残留方面的检测。笔者参照国家计量技术规范《测量不确定度评定与表示》和GB/T 21316-2007的要求，对高效液相色谱串联质谱法测定猪肉中磺胺多辛的不确定度进行了分析与评定。

1 试验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱三重四级杆串联质谱仪（LC-MS/MS）配有ESI源，型号Agilent1260-6430；氮吹装置，天津奥特赛因斯仪器有限公司；色谱柱为Agilent ZORBAXSBC18柱（2.1mm*50mm，1.8μm）；0.22μm水相滤膜，天津津腾实验设备有限公司。

磺胺多辛，德国Dr.Ehrenstorfer公司；猪肉，客户提供；化学试剂均为分析纯，国药集团；甲醇、乙腈均为色谱纯，美国TEDIA公司。

1.2 液相色谱与质谱条件

1.2.1 色谱条件

色谱柱为Agilent ZORBAX SB C18柱（2.1 mm*50 mm，1.8 μm）；流动相：质量分数0.1%的甲酸-乙腈（体积比为7∶3）；流速0.20 mL/min；柱温35℃；进样量10 μL。

1.2.2 质谱条件

质谱离子源为电喷雾正离子模式（ESI+），喷雾器压力15.0 Psi；质谱扫描采集方法为多反应监测（MRM）；脱溶剂气为氮气，温度350℃，流量12 L/min；碰撞气为高纯氮气；毛细管电压4000V。

1.3 测试方法

精密称取2 g经绞肉机处理均匀的猪肉样品于50 mL的塑料离心管中，加入15 g经干燥过的无水硫酸钠和20 mL分析纯的乙腈溶液，用匀浆机以8 000 r/min均浆提取2 min，以4 000 r/min离心3 min，上清液转入浓缩烧瓶中，残渣再分别用15 mL的乙腈按以上步骤重复提取两次，合并提取液后用旋转蒸发器于40℃水浴减压蒸干，准确加入1 mL流动相溶液和1 mL用上述溶液饱和过的正己烷震荡并超声5 min溶解残渣。将以上溶液转移至5 mL具塞聚乙烯塑料离心管中，漩涡1 min，以3 000 r/min离心3 min，弃去上层正己烷，再加入1mL上述正己烷重复以上步骤至下层水相变为透明液体，将下层清液过0.22 μm的滤膜，设定进样量10 μL后用高效液相色谱串联质谱测定。

用相应的空白样品提取液配制一系列的基质标准液，使其质量浓度分别为5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、100 μg/L 和 200 μg/L，待上机测试，以色谱峰面积对质量浓度作线性回归标准曲线用以定量。

1.4 评定数学模型

磺胺多辛含量计算公式：

式中：X—样品中磺胺多辛含量，μg/kg；

ρ—经处理待上机样品溶液中磺胺多辛的质量浓度，μg/L；

V—待上机样品溶液的体积，mL；

m—试样质量，g；

fR—磺胺多辛的回收率校正系数。

2 不确定度的主要组成部分

本试验涉及到的对测试结果有直接影响的仪器有天平和液质联用仪，在测试过程中所用到的量具和实验室的环境温度对结果也有一定的影响，样品的前处理，测试过程的随机效应以及标准曲线建立的过程对测试结果的不确定度也有较大的影响。可将以上不确定度的来源归属于以下几个方面：

a）样品称量操作引入的不确定度；

b）定容过程中体积引入的不确定度；

c） 液质联用仪仪器本身所引入的不确定度，包括仪器自带的进样针、工作站自动积分器、仪器的稳定性等，主要由仪器的校准证书来确定；

d）样品前处理过程引入的不确定度，主要包含萃取、浓缩和纯化等步骤，其中每一个操作步骤都会引入不确定度，其不确定度因素较多。此不确定度可通过对标准添加量的回收率测定进行判定；

e） 测试过程的随机效应所引入的不确定度，可通过对同一个样品重复平行测定后的结果进行计算和评定；

f）标准溶液配制过程引入的不确定度。

3 不确定度的评定

3.1 样品称样量引入的不确定度

3.2 测试过程中由定容体积所带入的不确定度

合并以上两部分所引入的不确定度，得到由体积引入的相对标准不确定度为：

3.3 液质联用仪仪器检测时引入的不确定度

根据校准证书提供：U=3%，k=2，则仪器引入的标准不确定度为：Urel（E）=3%/2=0.015 0。

3.4 样品前处理引入的不确定度

由于目标物质磺胺多辛不可能从样品基质中完全提取出来，加上浓缩和纯化过程的损失导致了前处理过程的不确定度较大，样品前处理过程产生的不确定度应用在空白猪肉样品中添加目标物磺胺多辛后计算其回收率的方式来进行评定，对6次添加质量浓度均为70 g/L的最终上机液进行测定，其回收率分别为：90.5%、96.2%、88.7%、89.2%、92.7%和87.5%，则目标组分磺胺多辛的平均回收率（R） 为90.8%，其标准偏差（S） 为3.18%，则由样品前处理引入的标准不确定度和相对标准不确定度分别为U（R） =S=0.031 8；Urel（R）=U（R）/R=0.035 0。

3.5 测试过程随机效应引入的不确定度

对同个一样品按照方法的要求重复进行10次平行有效试验测定, 对样品的均匀性、试剂的浓度和纯度、天平的重复性、容量瓶移液枪等体积刻度的重复性等因素引入的不确定度进行计算和评定。经测试后样品中磺胺多辛的含量分别为：34.25 μg/kg、36.38 μg/kg、33.52 μg/kg、36.85 μg/kg、 37.05 μg/kg、 34.52 μg/kg、35.57 μg/kg、 36.92 μg/kg、 33.09 μg/kg、35.52μg/kg，10次测定的平均值为：w=35.37μg/kg，根据贝塞尔公式计算所得10次试验的标准偏差为：1.456 6 μg/kg，则A类标准不确定度为U（w）=1.456 6/=0.467 4；A类相对标准不确定度为Urel（w）=U（w）/w=0.467 4/35.37=0.013 2。

3.6 标准溶液配制过程引入的不确定度

在本试验中首先需要配制一个质量浓度为1.0 mg/mL的磺胺多辛储备溶液，将此溶液稀释成质量浓度为1.0 μg/mL的标准溶液，再将其适当稀释后配置成一系列质量浓度为 5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L、100 μg/L 和 200 μg/L 的标准工作溶液来对样品中的目标物进行定量，在标准溶液配制的过程中会引入较多的不确定度。

故在配制磺胺多辛标准储备液的操作过程中所带入的综合相对标准不确定度可计算为：

在配制质量浓度为1 ug/mL磺胺多辛标液的过程中所引入的相对标准不确定度为：

质量浓度为5μg/L、10μg/L、20μg/L、40μg/L、100 μg/L和200 μg/L的标准工作溶液配制方法是：用1 mL移液器吸各取1 mL质量浓度为1 μg/mL的标准溶液于体积分别为200 mL、100 mL、50 mL、25 mL、10 mL和5 mL的A级容量瓶中，并用乙腈定容至刻度。以上6只容量瓶的容量允差分别为0.15 mL、0.10 mL、0.05 mL、0.03 mL、0.02 mL 和0.02mL，按照上述计算和评定方法，可计算出各个浓度梯度的标准溶液的相对标准不确定度分别为：0.00 582、0.00 583、0.00 583、0.00 584、0.00 591和0.00 624。综合判定时采用由质量浓度梯度为200 μg/L的标准溶液所引入最大相对不确定度值0.00624，故本步操作的相对不确定度为Urel（S4）=0.0062。

标准溶液配制过程中温度的变化会引入不确定度，乙腈体积膨胀系数为1.37×10-3/℃，实验室的温度为20℃，变化范围为5℃，由温度波动引起的10 mL容量瓶中乙腈溶液的体积偏差为10 mL×5℃×1.37×10-3/℃=0.0 685 mL，采用矩形分布进行分析和判定，则由实验室的温度波动所引入的标准不确定度为：U（T1）=0.0685/=0.0395mL；其相对不确定度可计算为：Urel（T1）=0.0 395/10=0.0 040。标准溶液配制过程中依次用到了10 mL、1 L和200 mL（选取在最后一步配制过程中引入不确定度最大的一只容量瓶进行计算）3种容量瓶，其相对不确定度均为0.0040。则因温度效应引入的相对标准不确定度为：

3.7 合成不确定度和扩展不确定度及测量结果的报告

相对扩展不确定度可由合成相对标准不确定度乘以包含因子求得，在95%置信水平下，k=2时，其相对扩展不确定度为：

U=k×Urel×100%=8.58%。

由试验计算得试样中磺胺多辛含量为35.37μg/kg，其扩展不确定度为：

U扩=ρU=35.37μg/kg×0.0858=3.03μg/kg。

磺胺多辛含量测定结果表示为：

w=（35.37±3.03）μg/kg，k=2。

4 结语

高效液相色谱串联质谱法测定猪肉中磺胺多辛的测试步骤比较复杂，测试中的不确定因素较多。从各个不确定度分量的评估结果来看，样品的前处理、液质联用仪的工作状况和测试过程的随机效应所引入的不确定度对合成不确定度的贡献较大。检测人员应充分了解影响测定结果不确定度的因素，对关键测试环节要引起重视，尽可能的减少各种影响检测结果不确定度的因素。在样品测试时尤其是前处理过程中要严格按照方法的要求进行规范操作，以减少由于样品处理和测试过程的随机效应所引入的不确定度，检测人员还应对测试仪器进行定期检查维护以确保仪器正常稳定的运转。

［1］ 中国计量科学研究院.JJF 1059-1999测量不确定度评定与表示［S］.北京：中国计量出版社，1999：1-27.

［2］ 中华人民共和国山东出入境检验检疫局，中华人民共和国吉林出入境检疫局，中国检验检疫科学研究院.GB/T 21316-2007动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法［S］.北京：中国标准出版社，2008：1-17.

［3］ 中国计量科学研究院.JJG 646-2006移液器检定规程［S］.北京：中国计量出版社，2007：1-13.

［4］ 中国计量科学研究院.JJG 700-1999微量注射器的标准［S］.北京：中国计量出版社，1999：1 536-1 537.

［5］ 国家标准物质研究中心.GB 12806-1991实验室玻璃仪器单标线容量瓶［S］.北京：中国标准出版社，2001：1-12.

Evaluation of uncertainty of sulfadoxine in pork by liquid chromatography tandem mass spectrometry

ZHANG Hou-sen*WU Xiao-jingWANG WeiFANG Wen-juan
（Jiangsu province physics and chemistry testing center，Jiangsu province nutrients and toxic testing center，Nanjing 210042，China）

Uncertainties from the test results of sulfadoxine in pork by liquid chromatography tandem mass spectrometry were analyzed and assessed.The relative expended uncertainty calculated from the experimental date was 8.58%，when the designed incredible probability was 95%（k=2）.The expended uncertainty was 3.03 g/kg，while the content of sulfadoxine in the sample was 35.37 g/kg.The contribution of the uncertainty introduced by the sample pretreatment was the largest part to the combined uncertainty.

uncertainty；liquid chromatography tandem mass spectrometry；sulfadoxine；pork

TS207.5+1

A

1673-6004（2012）03-0055-04

*张厚森，男，1978年出生，2005年毕业于江苏大学农产品贮藏与加工工程专业，工程师

2012-07-01

2012-07-08