宽体金线蛭鲜品和干品提取物体外抗凝血活性研究

万 明，唐仕欢，游 云，刘义梅，陈科力*

(1 湖北中医药大学 教育部中药资源和中药复方重点实验室， 武汉 430065；2 中国中医科学院 中药研究所，北京 100700)

水蛭始载于《神农本草经》，为疗效显著的常用中药.1986年召开的全国活血化瘀学术会议上，水蛭被确定为35种活血化瘀的中药材之一，并把水蛭划为活血作用最显著的前10种药之一.2010年版中国药典规定水蛭为水蛭科水蛭Hirudo nipponica Whitman,蚂蝗WhitmaniapigraWhitman和柳叶蚂蝗W.acranulata Whitman 3种动物的干燥体[1]，但据调查，目前国内药材市场上销售的商品药材只有宽体金线蛭WhitmaniapigraWhitman一种[2]，绝大多数地区临床上使用的水蛭主要为非吸血类且不含水蛭素的宽体金线蛭[3,4].药理研究表明，水蛭具有抗凝、抗血栓等作用[5]，宽体金线蛭不含有抗凝血活性物质水蛭素，但仍然具有抗凝活性.作者发现宽体金线蛭的抗凝血药理活性与其提取方法有关，其鲜品及干品脱脂后热提所得提取物具有较好的活性[6].针对宽体金线蛭鲜品和干品的2种提取物，本文做了进一步的体外药理实验，报告如下.

1 材料和仪器

1.1 实验仪器

普利生血凝仪，C2000-4；血流变测试仪，SA-5000.

1.2 药物的配制

水蛭药材(宽体金线蛭WhitmaniapigraWhitman)购于湖北中盛水蛭生物科技有限公司，物种经湖北中医药大学陈科力教授鉴定.鲜品以100 g为最小单位分装，直接放置于-70 ℃中冷冻保存；干品则用鲜品洗净后吊干(称清水货)，冷藏或-18 ℃以上保存.

4#水蛭(干品)提取物：取宽体金线蛭干品50 g，切薄片，用5倍量体积的石油醚脱脂2次，倾出石油醚后，加入10倍量体积的水，加热回流2 h，趁热过滤，第2次加入8倍体积的水，加热回流2 h，趁热过滤，合并两次提取液，离心，上清液冷冻干燥.

5#水蛭(鲜品)提取物：取冷冻宽体金线蛭鲜品200 g，自然解冻，剪碎，加3倍量生理盐水，高速分散仪匀浆30 min，加水补齐至10倍量，冰箱放置，浸泡12 h，纱布滤过，再加3倍量生理盐水，匀浆30 min，加水补齐至8倍量，冰箱放置，浸泡12 h，纱布滤过，合并滤液，低速离心，上清液冷冻干燥.

试剂：tris-base(Amersco公司)，血浆纤维蛋白原(FIB)含量测定试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司，批号：1320311；血浆部分凝血活酶时间(APTT)含量测定试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司，批号：111029、血浆凝血酶原时间(PT)含量测定试剂盒购自上海太阳生物技术有限公司，批号：105158.

Tris-Hcl配置：精密称取Tris 12.1g，加80 mL蒸馏水溶解后加入7 mL浓盐酸，放置到室温，加盐酸调pH 7.4，取5mL该溶液定容到50 mL容量瓶中，得到浓度为0.1 mol/L的溶液，4°C备用.

上述水蛭提取物分别称取400 mg，加Tris-Hcl 4mL溶解超声振荡15 min，10000 r/min离心5 min，取上清液，倍比稀释浓度分别为6.25、12.5、25、50、100 mg/mL.

1.3 实验动物

SD大鼠，雄性，250±10g，40只.

2 方法和结果

2.1 血浆的制备

取大鼠，腹腔注射乌拉坦麻醉，腹主动脉取血，3.8 %枸橼酸钠1∶9抗凝，离心取血浆备用.

2.2 分组及给药

每组平行3份，给药体积1∶5(30 μL药液加120 μL血浆)，分组及给药浓度如表1.

表1 分组及给药浓度表

2.3 检测指标

PT、APTT、FIB及血浆粘度. 检测结果如图1～9.

图1 不同浓度5#水蛭提取物对血浆PT值的影响

图2 不浓度4#水蛭提取物对血浆PT值的影响

图3 同浓度5#水蛭提取物对血浆APTT值的影响

图4 同浓度4#水蛭提取物对血浆APTT值的影响

图5 FIB标准曲线

图6 不同浓度5#水蛭提取物对血浆FIB值的影响

图7 不同浓度4#水蛭提取物对血浆FIB值的影响

不同提取方法的水蛭提取物对血浆PT、APTT、FIB均有不同程度的影响.实验数据表明，5#水蛭鲜品提取物对PT、APTT、FIB的作用较强，4#水蛭干品提取物作用稍弱， 5#、4#水蛭提取物对血浆PT、APTT、FIB的影响呈现明显量效关系(分别见图1、2、3、4、6、7)，即随着药物浓度的增高，凝血酶原时间及部分凝血活酶时间明显延长，血浆纤维蛋白原含量明显降低.不同提取方法的水蛭提取物对血浆粘度的影响不明显(图8、9).

图8 不同浓度5#水蛭提取物对血浆粘度的影响

图9 同浓度4#水蛭提取物对血浆粘度的影响

3 讨论

本实验结果表明，水蛭(宽体金线蛭)两种提取物具有明显的抗凝活性.一方面，水蛭提取物可以延长大鼠血浆PT和APTT，说明其可干扰内、外源性凝血因子的活性，而抑制凝血酶原向凝血酶的转化，使纤维蛋白原向纤维蛋白的转变过程受到抑制；可以明显降低血浆FIB含量.给药终浓度为5 mg/mL即显示出一定的延长PT、APTT时间，降低FIB含量的作用.5#提取物延长PT 50%有效剂量为20.19 mg/mL；延长APTT 50%有效剂量为16.75 mg/mL；降低FIB 50 %有效剂量为11.8 mg/mL.4#提取物延长PT 50%有效剂量大约为26.25 mg/mL；降低FIB 50%有效剂量为17.50 mg/mL.体外实验结果初步表明水蛭5#提取物的抗凝活性强于4#提取物，即鲜品宽体金线蛭的抗凝血活性强于干品，这为目前水蛭的临床应用提倡用鲜品提供了实验依据.我们将在进一步的试验中研究宽体金线蛭不同提取物中的抗凝活性物质.

[1]国家药典委员会.中国药典一部[S]. 北京：中国医药科技出版社, 2010:77-78.

[2]蔡少青，李胜华.常用中药材品种整理和质量研究(北方编，第5册)[M].北京：北京医科大学出版社，2001:600-609.

[3]宋大祥，冯钟琪.蚂蟥[M].北京：科学出版社，1978.

[4]杨 潼.蚂蟥的医药学意义[J].生物学通报,1996,31(3)：46.

[5]张希成,李 刚.水蛭的药理与临床应用[J].中医中药,2006,3(17):123.

[6]万 明,汪 蜜 ,刘义梅 ,等. 宽体金线蛭抗凝血活性物质的提取方法研究[J].中国医院药学杂志，2012，32(6): 6-8.