星形胶质细胞的体外生长特性

蔡 杰 彭会明 周洁萍 孙宗全 刘仁刚＊

星形胶质细胞的体外生长特性

蔡 杰1彭会明2周洁萍2孙宗全1刘仁刚2＊

（1华中科技大学同济医学院附属协和医院心外科，武汉430022；2华中科技大学同济医学院基础医学院解剖学系，武汉430030）

目的 研究纯化培养的星形胶质细胞的体外生长特性，作为进一步研究星形胶质细胞功能的依据。方法 将纯化的星形胶质细胞分为6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、72h、84h、96h、120h14个时间组，培养不同的时间后，采用细胞计数法绘制细胞生长曲线观察细胞的生长状况，用流式细胞学检测细胞周期各时相的变化并绘制增殖指数曲线，所得数据用SPSS软件进行统计学分析。结果 ①星形胶质细胞的生长曲线可明显的分为三个阶段：第一阶段为0至24h，在此时间内生长曲线平缓上升，其斜率为0.64。第二阶段为24h至84h，在此时间内生长曲线急剧上升，其斜率为2.69；此阶段中24h至48h时曲线最陡，斜率为3.94，细胞呈指数生长。第三阶段为84h至120h，在此时间内生长曲线走势平直，其斜率为-0.005。②星形胶质细胞的增殖指数在第一个细胞增殖周期内可以反映细胞的增殖状态，第一个细胞周期结束后，细胞的数量继续上升增殖指数却降低了。结论 培养的星形胶质细胞的生长过程分为潜伏期、指数生长期和停滞期三个阶段，其潜伏期为0至24h，指数生长期为24h至48h，停滞期为84h以后。单纯用增殖指数等类似的指标作为细胞增殖状态的判断标准是有一定局限性的，一定要将这些指标与细胞数量结合起来分析。

星形胶质细胞；增殖；细胞周期；生长曲线；增殖曲线

星形胶质细胞（Astrocyte，AS）是中枢神经系统内数目最多的一类细胞，它在神经系统发育、突触传递、神经组织修复与再生、神经免疫以及多种神经疾病中的病理机制等方面，都起着十分重要的作用［1-4］。正是因为星形胶质细胞的功能如此之大，所以对于它的研究已经成为近年来研究的热点。要研究其生物学功能，必须了解星形胶质细胞的体外生长特性。本实验对星形胶质细胞进行了培养，通过绘制星形胶质细胞的生长曲线和增殖指数曲线，探讨了体外培养的星形胶质细胞的生长特性。

材料和方法

1.实验动物、主要试剂和主要仪器

2d以内新生 Wistar大鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。DMEM／F12培养基、胎牛血清和马血清（Gibco公司）；多聚L-赖氨酸、胰蛋白酶和EDTA（Sigma公司）；青霉素、链霉素（华北制药厂）；台盼蓝（Sigma公司）；碘化丙啶（propidium iodide，PI，Sigma公司）。Shellab Model 2300型自控式二氧化碳培养箱（美国Sheldon公司）；OLYMPUS倒置相差显微镜（日本）；FACSCalibur流式细胞仪（美国Becton Dickinson公司）。

2.新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞的纯化培养

参照 McCarthy等（1980）方法［5］，并加以改良，进行新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞的原代培养。将出生2天以内的新生Wistar大白鼠10只，用75%的酒精浸泡消毒后，采用无菌方法迅速取出大脑，用冷的D-Hanks液清洗并剔除脑膜和血管，取大脑皮质，将组织剪碎为1mm3，用0.125%胰蛋白酶，37oC消化10min，过滤（200目尼龙滤网），离心（1000rpm 5min），去上清，加入DMEM／F12完全培养基制成细胞悬液。计数后按1×106／cm2接种于培养瓶，加入DMEM／F12完全培养基，在37℃，5%CO2培养箱中培养9天（每3天更换培养液一次），第9天将培养瓶置于恒温旋转摇床上37℃，240rpm，摇18h，去掉含有悬浮细胞的培养液，用DHanks液清洗贴壁细胞3次，即得纯化的星形胶质细胞。经免疫细胞化学SABC法检测，98%以上的细胞GFAP免疫反应为阳性。

3.细胞分组培养

将42个消毒过的25cm2培养瓶涂上多聚赖氨酸，然后将纯化的星型胶质细胞以1×105个／cm2的密度分组传代于培养瓶中。纯化的星形胶质细胞被分成14个时间组，每组3瓶。

接种后加入DMEM／F12完全培养基，在37℃，5%CO2环境下培养，在培养54h时换一次培养基。培养的细胞分别在14个时间点（6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、72h、84h、96h、120h）取材，每时间点均收集3瓶细胞，进行细胞计数和流式细胞仪检测。

4.细胞计数及细胞生长曲线的制作

将收集的每瓶细胞各制成细胞悬液，从每瓶的细胞悬液中随机取出4滴用血计数板进行细胞计数。以细胞数／ml为纵坐标，对应的培养时间为横坐标绘制成图，即为细胞生长曲线。

5.流式细胞仪检测细胞周期

将收集的不同时间点的星形胶质细胞，用预冷的70%乙醇固定、4℃过夜，上机前1h，1000rpm离心10min，去上清，加1ml消毒PBS，混匀，1000rpm离心10分钟，洗两次，加50μg／ml的PI染液0.5 ml和200μg／ml的Rnase酶0.5ml染色，在4℃环境中避光30min后，采用FACSCalibur型流式细胞仪进行细胞周期的检测。

每个样本检测10000个细胞，以细胞指数表示分布于细胞周期各时相的细胞百分比数，以增殖指数反映进入细胞增殖周期的细胞百分比数。

细胞指数＝各周期时相的细胞数／10000×100

增殖指数＝S期细胞指数＋G2／M期细胞指数

6.统计分析

所得数据应用SPSS12.0软件进行处理。以方差分析进行差异性分析，P＜0.05定为差异有显著性，数据以均数±标准差（¯x±s）表示。

结 果

1.形态学观察

纯化培养的星形胶质细胞细胞分裂增殖活动旺盛，相差显微镜下形态学特征：胞体较大而扁，形状不规则，星形胶质细胞的胞突尤其是初级胞突较多较长，呈放射状。细胞随着培养时间的延长，星形胶质细胞的密度不断的增大，细胞也不断地从未汇合、半汇合到完全汇合。星形胶质细胞在传代30h后，接种细胞贴壁、铺展、伸出突起，细胞增殖旺盛。（见图1）星形胶质细胞在传代50h后，细胞增殖旺盛，达到70%左右的汇合，可见细胞的分裂相。（见图2）星形胶质细胞在传代74h后，细胞已完全铺满，达到100%左右的汇合。（见图3）

图1 培养30h后，星形胶质细胞的生长情况（×200）；图2培养50h后，星形胶质细胞的生长情况（×100）；图3培养74h后，星形胶质细胞的生长情况（×100）；Fig.1 The growth of astrocytes after 30hours of incubation（×200）；Fig.2The growth of astrocytes after 50hours of incubation（×100）；Fig.3The growth of astrocytes after 74hours of incubation（×100）

2.细胞计数结果

纯化的星形胶质细胞在体外培养不同的时间后，细胞计数的结果见表1。细胞生长曲线见图4。

图4 体外培养的星形胶质细胞的生长曲线Fig.4 The growth curve of astrocytes in vitro

从图4中可见星形胶质细胞的生长曲线可明显的分为三个阶段：第一阶段为0至24h，在此时间内生长曲线平缓上升，其斜率为0.64。第二阶段为24h至84h，在此时间内生长曲线急剧上升，其斜率为2.69。第三阶段为84h至120h，在此时间内生长曲线走势平直，其斜率为-0.005。在第二阶段内曲线又可明显的分为三个部分：从24h到48h曲线最陡，斜率为3.94；从48h到72h曲线相对平缓，斜率为1.71；从72h到84h曲线又变得陡峭，斜率为2.17。

随着培养时间的延长，星形胶质细胞的细胞数不断的增加。在24h时细胞数较6h时增加了一倍，30h时细胞数又较24h时增加了一倍，48h时细胞数较30h时再次倍增，之后细胞生长较慢，到84h时细胞数达到顶峰，但并未达到48h时的两倍（见表1）。因此，48h为细胞增生率极限点，24h至48h为细胞指数生长期。

3.流式细胞仪检测结果

纯化的星形胶质细胞在体外培养不同的时间后，流式细胞仪检测结果见表1。

表1 不同时间点星形胶质细胞细胞周期各时相细胞指数和细胞数（¯x±s）Table 1 The cell index of different phases and the number after incubation for different hours（¯x±s）

当细胞进入G1期即进入了细胞增殖周期，由于PI染色经流式细胞仪检测细胞周期时，不能将G0期和G1期分开，故将S期和G2／M期的细胞定为进入细胞增殖周期的细胞，以增殖指数表示。

以增殖指数为纵坐标，对应的培养时间为横坐标绘制成图5，即为增殖指数曲线。

图5 增殖指数与培养时间的关系Fig.5 The relation between the index of proliferation and the hours

从表1和图5中可见增殖指数先是随着培养时间的增长而升高，至24h时达到最高；随后又随着培养时间的增长而降低，至54h时降低到与6h时接近的水平；在54h换培养基之后，增殖指数又有所升高，至72h时又有一个小的高峰，随后又迅速的降低并低于6h水平。经方差分析：当细胞培养不同时间时，星形胶质细胞细胞周期各时相的指数之间的差异均有极显著的统计学意义（P＜0.001）。以LSD法进行两两比较可知：6h、12h、48h、54h、60h和84h六组之间两两比较，增殖指数之间的差异均没有显著的统计学意义（P＞0.05）；其余各组之间两两比较并与以上六组之间两两比较，增殖指数之间的差异有非常显著的统计学意义（P＜0.01）。

讨 论

1.体外培养的星形胶质细胞的生长特性

体外培养的细胞在传代以后，细胞分裂增殖活动旺盛，细胞生长活跃。习惯上把体外培养的细胞的生长过程分为潜伏期、指数生长期和停滞期三个阶段［6-7］。我们的结果显示：星形胶质细胞的生长曲线也可明显的分为三个阶段：第一阶段为潜伏期，从0至24h，在此时间内生长趋势平缓上升，星形胶质细胞完成黏附、贴壁、铺展等过程。修复损伤，适应环境，恢复生长，但很少分裂。在24h时细胞数较6h时增加了一倍，细胞数首次倍增，因此，从24h起细胞进入第二阶段。在第二阶段星形胶质细胞的密度不断的增大，细胞也不断地从未汇合、半汇合到完全汇合（见图2、图3和图4）。这一阶段从24h至84h，又可明显的分为三个部分：从24h到48h为第一部分，曲线最陡，斜率为3.94，细胞数增长迅速，30h时细胞数较24h时增加了一倍、48h时细胞数较30h时再次倍增，此即指数生长期。指数生长期或称对数生长期，是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段，是进行各种实验最好的和最主要的阶段。从48h到72h为第二部分，曲线相对平缓，斜率为1.71，细胞数增长趋于缓慢；从72h到84h为第三部分，曲线又变得陡峭，斜率为2.17，这是因为54h换培养基之后给细胞补充了营养，细胞增殖又变得旺盛所致（见图5）。但这种增殖并未持久，从84h开始进入第三阶段，即停滞期或称平台期，曲线迅速变平，其斜率为-0.005，说明细胞的数量不再增加，维持在一定水平上。

2.体外培养的星形胶质细胞的增殖动力学

细胞的增殖过程，即由亲代细胞复制为子代细胞的过程称细胞增殖周期。细胞增殖周期分为G1期、S期、G2期和 M期［8］。DNA复制发生在S期，染色体分离发生在M期。细胞不增殖时处于G0期。

细胞增殖指数曲线显示：增殖指数先是随着培养时间的增长而升高，至24h时达到最高；随后又随着培养时间的增长而降低，至54h时降低到与6h时接近的水平。12h至24h时增殖指数的升高可能是由于细胞在完成黏附、贴壁、铺展等过程之后，大量处于静止期的细胞开始进入细胞增殖周期所致。24h至54h时增殖指数的降低的机制可能是大量细胞在完成了一个细胞周期以后又回到G0／G1期，进入下一个细胞周期的S期和G2／M期的细胞指数减少所致。在54h换培养基之后，增殖指数又有所升高，至72h时又有一个小的高峰，随后又迅速的降低并低于6h水平。这表明给细胞提供营养之后，只要生长空间许可，细胞仍然可以继续增殖，但随着细胞密度越来越大，细胞增殖的速度也越来越慢。

将细胞生长曲线和细胞增殖指数曲线进行比较我们发现增殖指数的高低并不能准确反映细胞的增殖情况。其原因有两点：其一，在18h时增殖指数已上升到一个非常高的水平，但是细胞的数量却在24h时才倍增。为什么会出现这一现象呢？这是因为G1期、S期、G2期和M期是依次进行的，只有M期结束细胞才能倍增。从表1中可见18h时G1期细胞指数明显减少，S期细胞指数明显增加，G2／M期细胞指数却未见增长，说明处于S期的细胞还未分裂，所以细胞数的增长并不明显。24h时G1期细胞指数进一步减少，S期细胞指数仍然很高，G2／M期细胞指数也增至很高，说明大量S期的细胞进入M期开始分裂，所以细胞数的增长非常明显。其二，从24h至54h之间，细胞的增殖指数不断的降低，但是细胞数却依然不断的增高。出现这一现象的原因可能是：细胞在24h时完成一个细胞周期后，大量分裂的细胞又进入G1期，造成S期和G2／M期细胞指数降低，但是细胞仍然处于增殖旺盛的阶段，所以细胞数量仍然在不断的增加。许多研究者常用S期细胞指数、有丝分裂指数、5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记方法、氚胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）标记方法或增殖指数（S＋G2／M）反映细胞的增殖状态，我们的实验结果表明这些方法都有一定的局限性。在没有任何影响细胞增殖的因素存在的情况下，这些指标在第一个细胞增殖周期内可以反映细胞的增殖状态，第一个细胞周期结束后，大量的细胞进入G1期，这些指标都会有所减低，但是细胞却依然增殖旺盛，再用它们来作为细胞增殖状态的判断标准就不确切了，此时要判断细胞是否处于增殖状态，一定要将这些指标与细胞数量结合起来分析。在加入了影响细胞增殖的药物后，更要将这些指标与细胞数结合起来共同作为细胞是否处于增殖状态的判断标准。特别是在加入了对细胞增殖有抑制作用的药物后更是如此：此时细胞的数量可能明显的减少，但是这些增殖指标却可能显著的增高，这只能说明加入增殖抑制药物后阻滞了细胞周期的进程，使细胞周期的时限延长，因而造成了这些指标的升高。

3.接触抑制在星形胶质细胞增殖中的作用

从24h到84h，30h时细胞数较24h时增加了一倍，48h时细胞数较30h时再次倍增，之后细胞生长较慢，到84h时细胞数达到顶峰，但并未达到48h时的两倍（见表1）。以上表明：随着培养时间的延长，星形胶质细胞的细胞数不断地增加，细胞的倍增时间也不断地增加。其原因可能有两点：一是星形胶质细胞增长旺盛，培养液中营养供应越来越不足，培养液中积聚的细胞代谢产物越来越多。二是星形胶质细胞的密度越来越大，越来越多的细胞因为接触而处于增殖抑制的状态。我们在培养细胞54h后，给细胞换了培养基。结果显示：在54h换培养基之后，增殖指数又有所升高，至72h时有一个小的高峰，随后迅速的降低并低于6h水平；生长曲线的斜率也从48h到72h的1.71，增加到从72h到84h的2.17，随后迅速的降至-0.005。这一结果表明：营养成分的缺乏确实影响了星形胶质细胞的生长，但是接触抑制的作用更重要，当细胞的密度达到一定程度细胞相互接触时，即使提供丰富的营养，细胞也不会再行增殖［9-10］。

体外培养的细胞的生长过程可分为潜伏期、指数生长期和停滞期三个阶段。我们的结果显示：星形胶质细胞的潜伏期为0至24h，指数生长期为24h至48h，停滞期为84h以后。细胞增殖的停滞与接触抑制有关。单纯用增殖指数等类似的指标作为细胞增殖状态的判断标准是有一定局限性的，一定要将这些指标与细胞数量结合起来分析。

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Growth characteristics of astrocytes in vitro

Cai Jie1，Peng Huiming2，Zhou Jieping2，Sun Zongquan1，Liu Rengang2＊
（1Department of Cardiovascular Surgery，Union Hospital，Tongji Medical college of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022；2Department of Anatomy，Tongji Medical college of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030 China）

ObjectiveThis study is aiming to investigate the growth characteristics of the purified astrocytes in vitro，which the next study will base on.MethodsPurified astrocytes from cerebral cortex of newborn rats were divided into 14groups.After incubation for different hours（6h、12h、18h、24h、30h、36h、42h、48h、54h、60h、72h、84h、96h、120h），we observed the proliferation by cell counting and drew the growth curve of astrocytes，and we observed the cell cycle by the flow cytometer and drew the proliferation index curve of astrocytes The corresponding data were analyzed with SPSS statistical software.Results①The growth curve of astrocytes were divided into three phases.The first phase continues from 0to 24hours，the slope rate is 0.64.The second phase continues from 24to 84hours，the slope rate is 2.69.At the first part of the phase（from 24to 48hours）the slope rate is 3.94and the growth of cells is the fastest in the total process.The cells start the third phase after 84hours，the slope rate is-0.005.②The proliferation index of astrocytes can reflect the proliferation of astrocytes in the first cell cycle.After the first cell cycle，the proliferation index reduces but the number of the cells is increase.Conclusion The growth process of purified astrocytes can be divided into 3phases：latent phase（from 0to 24hours）、logarithmic growth phase（from 24to 48hours）and stagnate phase （from 84to 120hours）.By using merely the indexes，such as the proliferation index，it is circumscribed to estimate the proliferation of astrocytes.

Astrocyte；Proliferation；Cell cycle；Growth curve；Proliferation curve

R329

A

10.3870／zgzzhx.2011.05.013

2011-02-10

2011-04-01

国家自然科学基金（30570568）

蔡杰，男（1975年），汉族，主治医师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）