转录因子Snail在非小细胞肺癌中的表达及意义

赵晓华 张明月 崔红学 都彩菊 刘宝堂

转录因子Snail在非小细胞肺癌中的表达及意义

赵晓华 张明月 崔红学 都彩菊 刘宝堂＊

（山东省潍坊医学院附属医院普胸外科，山东261031）

目的 检测转录因子Snail mRNA及蛋白在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中的表达，探讨Snail在NSCLC发生发展中的作用。方法 采用免疫组织化学、RT-PCR的方法检测NSCLC、癌旁相对正常肺组织（＞5cm）中转录因子Snail蛋白及mRNA的表达，并分析其与临床病理参数之间的关系。结果 NSCLC组织中Snail mRNA的阳性表达率（82.7%）高于癌旁相对正常肺组织（23.1%，P＜0.05）；NSCLC组织中Snail mRNA的阳性表达量（1.368±0.614）高于癌旁相对正常肺组织（0.579±0.217，P＜0.05）。NSCLC组织中Snail蛋白的阳性表达率（80.8%）高于癌旁相对正常肺组织（23.1%，P＜0.05），且癌组织中Snail蛋白阳性表达率与TNM 分期、淋巴结转移有关（P＜0.05），而与组织分型、分化程度、吸烟史无关（P＞0.05）。结论 NSCLC的癌变、侵袭、转移可能与Snail蛋白、mRNA的高表达有关。

Snail；肺肿瘤；mRNA；蛋白

肺癌作为一种恶性肿瘤，其发病率和死亡率近年来一直呈上升趋势，已成为21世纪全球面临的严峻的健康问题。在中国，据预测到2025年，肺癌患者将达到100万，居世界恶性肿瘤第一位。肿瘤的发生发展、侵袭转移是多因素共同作用的复杂的病理过程［1］。

上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transi-tion，EMT）是多细胞生物胚胎发生中的基础过程，也存在于多种慢性疾病以及肿瘤的发生发展过程中，它以上皮细胞极性丧失及其间质特性的获得为主要特征。EMT与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移有着密切的关系［2］。Snail家族成员作为一类锌指转录因子在EMT过程中发挥着主要作用［3］。大量研究表明，转录因子Snail通过与E-cadherin启动子区的 E-盒（E-box）结合，下调 E-cadherin的表达进而诱导EMT的发生［4］。EMT与肿瘤细胞的原位侵袭和远处转移有着密切的关系，目前已成为肿瘤研究中的热点。既往的研究表明：转录因子Snail高表达于乳腺癌［5］、胃癌［6］、肝癌［7］、结肠癌［8］中，并与乳腺癌组织学分级、淋巴结转移密切相关。为了探讨转录因子Snail在NSCLC发病中的作用，本研究用免疫组织化学、RT-PCR检测NSCLC、癌旁相对正常肺组织中Snail蛋白及mRNA的表达水平。

材料和方法

1.材料

1.1 实验标本

收集潍坊医学院附属医院2008年1月至2011年1月手术切除肺癌标本52例，分别取肿瘤组织和癌旁正常组织（＞5cm），置于-150℃冰箱保存备用。所有病例均经病理证实，术前均未采取放疗、化疗和免疫治疗。患者平均年龄55.8岁（41岁-80岁），其中男性35例，女性17例。肺癌标本根据世界卫生组织2004年的分类标准分为鳞癌30例，腺癌22例；其中高分化10例，中分化26例，低分化16例。20例有淋巴结转移，依据国际抗癌联盟1997年修订的肺癌TNM分期标准：I期12例，II期18例，III期12例，IV期10例。

1.2 主要试剂

Taq polymerase购自Invitrogen公司；Snail抗体购自美国zymed公司；TRIquick Reagent购自北京索莱宝科技有限公司；MmLV第一链cDNA合成试剂盒、PCR扩增试剂盒购自上海生工生物有限公司。

2.方法

2.1 免疫组织化学方法检测Snail蛋白表达

石蜡切片经抗原修复和血清封闭后，在切片上滴加1：100抗Snail抗体，4℃过夜，次日滴加抗山羊IgG及辣根过氧化物酶，DAB显色，苏木素复染，以不加一抗的组织切片作为阴性对照，以已知阳性反应切片作为阳性对照。阳性着色为棕黄色颗粒，以胞核着色为主，部分伴胞质着色。高倍镜下随机选择5个视野，计数1000个细胞，并按阳性细胞百分率评分，＜10%为1分，＞10%为2分，＞50%为3分，＞80%为4分。按显色程度评分：染色弱为1分，中等染色为2分，强染色为3分。结果取2项评分之和，分为4级：0-1分为阴性（一），2-3分为弱阳性（＋），4-5分为中度阳性（＋ ＋ ），6-7分为强阳性（＋＋＋）［9］。

2.2 RT-PCR检测Snail mRNA表达情况

用TRIquick Reagent提取NSCLC及癌旁正常组织中的总RNA，逆转录合成第一链cDNA，扩增目的基因。Snail上游引物为5＇-CCACTATGCCGCGCTCTTT-3＇，下游引物为5＇-TCAGCGGGGACATCCTGAGCA-3＇，目的条带长度为799bp。以β-actin作为内参照，β-actin上游引物为5＇-CCTGTGGCATCCACGAAACT -3＇，下 游 引 物 为 5＇-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3＇，目的条带长度为315bp。PCR琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后取出凝胶，于BiospectrumAC凝胶成像分析系统下照相并扫描分析。

3.统计学分析

组织中Snail mRNA、蛋白表达率分析及蛋白表达与临床病理特征的关系采用t检验，mRNA的表达量用独立样本t检验，相关性分析用线性相关，以P＜0.05认为差异有统计学意义。

结 果

1.NSCLC及癌旁相对正常肺组织中Snail蛋白的表达

52例NSCLC组织中有42例检测到Snail蛋白的表达（图1），表达率为80.8%，癌旁相对正常肺组织中有12例检测到Snail蛋白的表达，其表达率为23.1%，两者差异存在统计学意义（χ2＝34.667，P＜0.005）。

图1 Snail在NSCLC中的表达 免疫组化染色 ×200Fig.1 Expression of Snail in non-small cell lung cancer IHC×200

2.Snail蛋白表达与NSCLC临床病理参数的关系

分析52例NSCLC中Snail蛋白表达与患者的吸烟史、TNM分期、分化程度、组织分型及淋巴结转移等临床病理参数的关系，发现Snail蛋白表达与TNM分期、淋巴结转移有关，而与组织分型、分化程度及吸烟史无关（表1）。

表1 Snail蛋白表达与NSCLC临床病理参数的关系Table 1 Expression ofSnail protein and clinicopathologic characteristics innon-small cell lung cancer

3.NSCLC及癌旁相对正常肺组织中Snail mRNA的表达

Snail mRNA在 NSCLC组织中表达率为82.7%（43／52），在癌旁相对正常肺组织中表达率为23.1%（12／52），两者的阳性表达率的差异有统计学意义（χ2＝37.085，P＜0.005）。Snail mRNA 的表达量用组织中mRNA的OD值与内参照β-actin的OD值做比值表示，结果显示NSCLC组织中Snail mRNA的表达量（1.368±0.614）明显高于癌旁相对正常肺组织（0.579±0.217）（P＜0.01）（图2）。

图2 Snail mRNA在NSCLC和癌旁正常组织中的表达水平A：Snail mRNA经 RT-PCR后的电泳结果，以β-actin作内参照1：Marker；Lane2，3：NSCLC组织；Lane4，5：癌旁正常组织。B：Snail mRNA与β-actin相比后的相对表达量。Fig.2 Expression level of Snail mRNA in lung cancer tissues and normal lung tissuesA：RT-PCR results ofSnail mRNA expression level.β-actin served as an internal control；1：Marker；Lane 2，3：NSCLC tissues；Lane 4，5：normal lung tissues；B：the histogram of relative expression rate of Snail mRNA compared toβ-actin

讨 论

EMT发生于多种生理、病理过程，如胚胎发育、肿瘤转移等，其共同的细胞学机制为细胞间粘附的丧失与细胞迁移力的获得［10］。EMT是上皮细胞在与周围间质的相互作用过程中逐渐获得了某些间质细胞特有性状的现象［11］。肿瘤细胞也因此获得较强的侵袭和移动能力［12］。EMT不仅包括细胞形态学的改变，还包括其基因型的改变，肿瘤细胞的代谢活性也因此发生了改变。Snail是存在于果蝇、鼠、人等生物体内的一种碱性螺旋-环-螺旋转录因子，属于锌指蛋白家族成员。锌指转录因子Snail能有效地诱导EMT，因此在对肿瘤发生及侵袭能力的研究中受到越来越多的关注［13］。随着近年来对肿瘤侵袭转移机制的关注，陆续有研究发现Snail能提高多种肿瘤的侵袭能力。近年来，Snail在肿瘤转移中的作用越来越受到人们的关注，研究表明Snail高表达于胃癌、结肠癌、肝癌等肿瘤组织中，并与这些肿瘤的淋巴结转移密切相关。

肿瘤转移是一个复杂的多步骤、多基因参与的过程，肿瘤细胞必须先突破血管壁进入血管，在血液循环中存活，再从血管外渗，最中在远隔部位形成为转移灶。在这个过程中，EMT不可缺少。在肿瘤转移过程中，原位肿瘤细胞先失去细胞上皮性特征（各种细胞连接的松散、崩解以及上皮性标记物的丢失），再获得间充质的特点，如细胞骨架的重排，细胞外基质的合成增加及间充质标记物的获得，从而获得侵袭转移能力并从原来的位置逃逸。

本研究结果显示NSCLC组织中Snail mRNA的阳性表达率和量均高于癌旁相对正常肺组织。NSCLC组织中Snail蛋白的阳性表达率高于癌旁相对正常肺组织，且癌组织中Snail蛋白阳性表达率与组织学分级、淋巴结转移有关，而与TNM分期、分化程度无关，表明NSCLC的癌变、侵袭、转移可能与Snail蛋白、mRNA的高表达有关。

［1］李娟，黎友伦，程序 .Nucleostemin基因在非小细胞肺癌组织中的表达及意义 .中国组织化学与细胞化学杂志，2010，19（3）：229-233

［2］Huber MA，Kraut N，Beug H，et al.Molecular requirements for epithelial-mesenchymal transition during tumor progression.Current Opinion in Cell Biology，2005，17：548-558

［3］Soinila J，Soinila S.Interaction of calcitonin gene-related peptide（CGRP），substance P and conventional autonom-ic agonists in rat subsmandibular salivary peroxidase release in vitro.Auton Neurosci，2001，86（3）：163-169

［4］Ray ME，Mehra R，Sandler H M，et a1.E-cadherin protein expression predicts prostate cancer salvage radiotherapy outcomes.J Urol，2006，176（4Pt 1）：1409-1414

［5］CÔme C，Arnoux V，Bibeau F，et al .Roles of the transcription factors snail and slug during mammary morphogenesis and breast carcinoma progression.J Mammary Gland Biol Neoplasia，2004，9（2）：183-193

［6］Rosivatz E，Becker I，Specht K，et al.Differential expression of the epithelial-mesenchymal transition regulators snail，SIP1，and twist in gastric cancer.Am J Pathol，2002，161（5）：1881-1891

［7］Miyoshi A，Kitajima Y，Kido S，et al.Snail accelerates cancer invasion by upregulating MMP expression and is associated with poor prognosis of hepatocellular carcinoma.Br J Cancer，2005，92（2）：252-258

［8］Pálmer HG，Larriba MJ，García JM，et al.The transcription factor SNAIL represses vitamin D receptor expression and responsiveness in human colon cancer.Nat Med，2004，10（9）：917-919

［9］Batlle E，Sancho E，Franci C，et a1.The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.Nat Cell Biol，2000，2（2）：84-89

［10］Boyer B，Vallés AM，Edme N.Induction and regulation of epithelial-mesenchymal transitions.Biochem Pharmacol，2000，60（8）：1091-1099

［11］Ahlstrom JD，Erickson CA.New views on the neural crest epithelial-mesenchymal transition and neuroepithelial interkinetic nuclear migration.Commun Integr Biol，2009，2（6）：489-493

［12］Fernando RI，Litzinger M，Trono P，et al.The T-box transcription factor Brachyury promotes epithelial-mesenchymal transition in human tumor cells.J Clin Invest，2010，120（2）：533-544

［13］Yao B，Huang W ，Huang Y，et a1.A study on the localization and istribution of GnRH and its receptor in rat submaxillary glands by immunohistochemical，in stiu hybridization and RT-PCR.Life Sci，2003，72（25）：2895-2904

Expression and significance of transcription factor Snail in the non-small cell lung cancer

Zhao XiaoHua，Zhang MingYue，Cui HongXue，Dou CaiJu，Liu BaoTang＊
（General Surgery，Affiliated hospital of Weifang Medical college，Weifang261031，China）

ObjectiveTo detect the expression of transcription factor Snail mRNA and protein，and investigate the role of Snail in the development of non-small cell lung cancer（NSCLC）.MethodsThe expression of Snail protein and mRNA in NSCLC and normal lung tissue was detected by immunohistochemistry and RT-PCR.The relationship of Snail and clinicothological parameters was analyzed.ResultsThe positive rate of Snail mRNA were significantly higher in cancer tissues（82.7%）than that in normal lung tissues（23.1%，P＜0.05）.The expression of Snail mRNA were significantly higher in cancer tissues（1.368±0.614）than that in normal lung tissues（0.579±0.217，P＜0.05）.The positive rate of Snail protein were significantly higher in cancer tissues（80.8%）than that in normal lung tissues（23.1%，P＜0.05）.The expression of Snail in cancer tissue were correlated with lymphnode metastasis and TNM stage（P＜0.05）and were not correlated with histology type，differentiation grade and smoking history （P＞0.05）.ConclusionThe carcinogenesis，invasion and metastasis of NSCLC may be correlated to overexpression of Snail protein and mRNA.

Snail；Lung neoplasms；mRNA；Protein

R734.2

A

10.3870／zgzzhx.2011.05.003

2011-02-10

2011-08-01

国家自然科学基金（81072068），山东省潍坊医学院青年教师启动基金（KQ07037）

赵晓华，男（1976年），汉族，主治医师。

＊通讯作者（To whom correspondence should be addressed）