肿瘤坏死因子受体家族与脊髓损伤后的细胞凋亡信号传递

禹晓东(综述)，许向东(审校)

(解放军第三医院骨科，陕西宝鸡721004)

目前，脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)后的凋亡信号传递机制仍未完全明确。因此，了解SCI后上游凋亡信号如何传递以及传递途径中的关键蛋白显得尤为重要。这有利于针对性的选择治疗策略以减轻损伤、恢复神经功能。众多的研究中，越来越多的目光集中于肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)家族，TNFR家族广泛地参与由炎性反应和淋巴细胞激活导致的细胞凋亡和其他类型的程序性细胞死亡，依照不同的细胞类型及环境因素，这些受体产生不同的信号反应。

最近的研究揭示了TNFR家族的两个成员，即TNFR-1和Fas信号转导复合体的结构及其细胞定位［1］。胞外的多种生物化学信号通过TNFR-1和Fas复合体转导入胞内，引起细胞凋亡。最近的一项研究中，将剔除TNFR-1和Fas或封闭TNFR-1和Fas与其配体的相互作用的动物制作SCI模型，与对照组相比，其神经功能评分明显升高［2］。

1 Fas信号通路

Fas(CD95，Apo-1)属于Ⅰ型跨膜蛋白，隶属于TNFR家族，是已知的6个死亡受体之一。其胞外部分包含三个富半胱氨酸区域(cysteine-rich domains，CRDs)，其中CRD 1是Fas配体结合区域，当Fas构成三聚体后，可与Fas配体结合，CRD 2和CRD 3也在Fas与其配体的结合中发挥重要作用［3］。Fas在胞内的部分称为死亡结构域(death domain，DD)，通过可与其结合的蛋白传递早期凋亡信号。Fas的典型配体称为 FasL(CD95L，Apo-1L，CD178，TNFSF6)，这是一个281氨基酸长度的Ⅱ型跨膜蛋白，特异性的定位于免疫细胞和CNS细胞膜上［4］。

在神经系统中，Fas的激活可以引发神经元与胶质细胞的凋亡［5］。目前对于淋巴细胞凋亡中经Fas途径的信号传递机制已比较清楚，但对其在CNS内的信号传递方式及其时空定位仍未完全明确。但无论如何，Fas和FasL在SCI后的神经元与神经胶质细胞凋亡过程中发挥了关键性作用，这是毋庸置疑的。众多研究揭示，Fas与FasL无论是在体外培养的神经元或胶质细胞，还是在体内CNS内均有表达，但表达水平在正常状态下极其低下。与其相反，包括SCI在内的多种CNS损伤或疾病状态下，可检测到Fas与FasL表达水平的显著升高［6］。

新的试验证据显示，应用FasL的中和剂可以显著减少SCI后神经元与胶质细胞的凋亡数量和凋亡范围。试验中，SCI大鼠于伤后使用FasL的单克隆抗体处理，数周后测量其后肢运动功能与动作诱发电位，均优于未经任何处理的对照组，对其脊髓标本进行研究后发现，其神经纤维的再生数量与生长相关蛋白43表达水平均高于对照组［7］。Yoshino等［8］采用剔除Fas和FasL的转基因鼠制作SCI模型，发现与对照组相比，转基因鼠SCI后损伤范围减小、细胞凋亡数量减少、神经功能恢复速度增加。这说明Fas和FasL在SCI后的神经元与神经胶质细胞凋亡中发挥关键作用。但其具体机制仍需要进一步研究:损伤后FasL的来源及其作用靶位需进一步明确;损伤后轴突再生与运动功能恢复的相关性亦需深入探讨;再者，在上述试验中，FasL抗体是于损伤后即刻应用，那么，需要进一步的试验说明FasL抗体最晚可于损伤后多久应用才能取得理想的治疗效果，这有利于制订精确的药物治疗方案。

Fas介导的信号转导由死亡介导信号复合体(death-inducing signal complex，DISC)完成，包括 Fas、Fas相关死亡结构域(Fas-associated death domain，FADD)、caspase-8、caspase-10。其转导效率在不同类型的细胞内存在差异。在“Ⅰ型”细胞内，Fas激活后DISC表达量高，转导效率高，且其介导的凋亡过程不能被Bcl-2家族蛋白阻断;而在“Ⅱ型”细胞内，DISC在Fas激活后表达量较低，转导效率较低，凋亡过程可被Bcl-2家族蛋白阻断［9］。CNS内为何存在两种不同的Fas凋亡转导效率，其分子机制仍不明确。

Fas在细胞膜上的定位差异可能是存在两种不同转导效率的原因之一。将T细胞膜上的Fas蛋白通过特殊技术转移到某一特定区域后，其在相同胞外信号强度刺激下的凋亡数量明显增加［10］。进一步的试验证实，在“Ⅰ型”细胞中，一部分Fas定位于胞膜的卵磷脂区域内，而在“Ⅱ型”细胞中，全部Fas均未定位于卵磷脂区域。正是定位于卵磷脂区域的Fas可介导“Ⅰ型”细胞在极低强度的胞外信号作用下发生凋亡，而同样强度的信号并不能导致“Ⅱ型”细胞的凋亡［11］。那么，CNS内是否明确存在“Ⅰ型”和“Ⅱ型”细胞以及为何卵磷脂区域可以提高Fas对凋亡信号的敏感性尚需进一步的研究。可以想象，进一步深入对Fas和FasL及其作用靶位的研究将极大地推动SCI治疗的进展。

2 阻断Fas信号通路的研究进展

人们已经对数种阻断了Fas信号途径的细胞模型进行了详细的研究，包括将细胞膜上的Fas溶解或是使细胞分泌可以竞争性地结合FasL的蛋白。研究者采用腺病毒蛋白E3降解Fas后，观测到了细胞凋亡率的降低［12］。此外，蛋白激酶C也可以调节Fas介导的凋亡过程，蛋白激酶C活化后通过减少Bid蛋白的活化抑制Fas介导的细胞凋亡。值得注意的是，这种效应仅出现于“Ⅱ型”细胞，而在“Ⅰ型”细胞中并无任何影响［13］。由此推测，蛋白激酶C可能是通过影响Bcl-2蛋白表达来达到抑制凋亡的目的。

细胞内的长链型FLIP(FLICE-like inhibitory protein long form，c-FLIPL)近来日益受到重视，c-FLIPL包含一个死亡效应结构域，在Fas介导的凋亡信号通路中可能同时扮演了启动子与沉默子的角色［14］。除c-FLIPL之外，另外一种被称为lifeguard的蛋白也可以阻断Fas介导的凋亡信号通路，lifeguard可以直接结合于Fas受体上，阻止Fas和FasL之间的结合［15］。在大鼠体内，lifeguard的同源蛋白又被称为神经膜蛋白35，它随着大鼠CNS的发育表达量不断上调，并且在成年大鼠的脊髓内呈稳定的高表达状态，尤其在数种类型的神经元树突中表达量最高［16］。研究发现，lifeguard蛋白的表达主要受磷脂酰肌醇3激酶-AKT/PKB途径的调节［17］。在大鼠体内，lifeguard蛋白在小脑的颗粒样神经元中表达量最高，而对这类颗粒样神经元的体外培养也证实，其具有对抗Fas介导的细胞凋亡的能力［18］。而进一步的试验中，研究者采用编码lifeguard蛋白mRNA的反义寡核苷酸对培养的大鼠小脑颗粒样神经元进行转染，以及采用RNA沉默技术使lifeguard蛋白的表达量下调，均检测到了细胞对Fas介导的细胞凋亡的敏感性的升高以及Fas下游caspase-8活化量的增加［19］。这说明lifeguard蛋白在颗粒样神经元对抗Fas介导的细胞凋亡过程中发挥了重要作用，至于lifeguard蛋白是否也会在其他类型的神经元中发挥类似的凋亡保护作用，尚需进一步的试验证据。

3 TNFR信号通路

关于TNFR1和TNFR2在正常或SCI后的脊髓内的表达，目前仍存在争议。Yan等［20］报道，在正常脊髓中并没有明确的检测到TNFR1和TNFR2的表达;而与之相反，有研究发现，在正常脊髓的DRGn传入纤维、背根移行区以及脊髓后角的薄层Ⅰ区和Ⅱ区均检测到了TNFR1表达，但并无TNFR2存在证据［21］。SCI后，TNFR1 和 TNFR2的表达量显著升高，并局限性地定位于神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞内，这提示TNFR1和TNFR2可能在SCI后的病理学变化中发挥重要作用。在一项试验中，采用剔除TNFR1的转基因鼠制作SCI模型，与使用野生型鼠的对照组相比，试验组细胞凋亡数量、神经损伤范围均远大于对照组，神经功能恢复能力则较对照组为差。进一步对两组损伤局部进行研究后发现，转基因组出现了核因子κB结合活性的降低，同时还有cIAP-2表达量的降低以及caspase-3活化的增加。类似的结果也出现在剔除编码TNFR2蛋白序列的转基因鼠SCI模型中［22］。以上的研究结果支持了TNFR1和TNFR2可能在SCI后限制细胞凋亡范围的观点。

有研究显示，TNFR1信号途径包含两个分子结构和空间定位都不相同的分子复合体，这两个复合体分别激活核因子κB与caspase系统［23］。在凋亡信号传递早期，TNF与 TNFR1结合后，一个包括TRADD、RIP1、TRAF1、TRAF2 和 cIAP-1 的 TNFR 受体相关复合体Ⅰ开始启动并转导胞外信号，引发核因子κB的活化，参与抑制凋亡进程。而另外一个复合体Ⅱ则存在于胞质内，与TNFR分离，由TRADD、RIP1、FADD和caspase-8组成，参与另外一条TNFR1相关的信号转导途径。当复合体Ⅰ转导胞外信号，引发核因子κB的活化数量足够时，胞内的抗凋亡机制激活，复合体Ⅱ中caspase-8的活化受到抑制;而当复合体Ⅰ转导胞外信号，引发核因子κB的活化数量微少时，复合体Ⅱ中的caspase-8则开始活化，参与促进凋亡进程。由此可见，核因子κB的活化数量是决定复合体Ⅱ是否参与TNFR1相关的信号转导途径、从而诱导凋亡的最关键因素。

SCI后，脊髓神经元TNFR1相关信号转导途径被激活，其结局究竟是存活还是凋亡?最近的试验对其进行了更加深入的研究［24］。结果显示，有一部分TNFR1定位于细胞膜上的卵磷脂区域内。已经证实，卵磷脂区域可作为包括FAS、TNFR1在内的多种信号转导受体存在的平台。在正常脊髓内，TNFR1信号转导复合体包括 TRADD、RIP、TRAF1、TRAF2和 cIAP-1，而已知在体内由 TNFR1-TRADD-RIPTRAF2复合体传递的为细胞存活信号，由此有理由推测，TNFR1信号途径在正常脊髓内实际是促进细胞存活的信号途径。

SCI后，TNFR1快速移位至细胞膜的卵磷脂区域，通过信号转导复合体引起一过性的核因子κB活化数量增加，然后RIP和cIAP-1自TNFR1上解离，而cIAP-2、FADD则与TNFR1结合，开始介导细胞凋亡［25］。由此认为，TNFR1信号途径在正常脊髓内促进细胞存活，而在SCI后导致细胞凋亡，这种变化是由TNFR1信号转导复合体中衔接蛋白的变化导致的。RIP与TNFR1的解离可能是导致核因子κB途径表达下调，致使细胞凋亡增加的始动因素。而且，cIAP-1、IAP-2和TRAF1已经被证实是核因子κB的作用靶位，SCI导致的核因子κB活化的下调也可能同时导致TNFR1-TRAF-IAP对caspase-8活化抑制能力的下调，从而使caspase-8活化增加，致使细胞凋亡。SCI后30 min，caspase-8即可被检测出定位于TNFR1信号转导复合体中，这也证实了FADD通过与TRADD结合，激活caspase-8从而诱导凋亡的推测［26］。有学者曾通过对培养状态下神经元的研究发现，TNFR1信号途径包含两个分子结构和空间定位都不相同的分子复合体，分别发挥不同作用，然而在体内试验中，并未发现这两种复合体如同在体外般的显著区别。在试验中发现，复合体Ⅰ在SCI 30 min后即可激活 caspase-8诱导凋亡［27］。因此，在 SCI后，TRADD的死亡结构域可能在FADD及caspase-8的活化过程中起着决定性的调控作用。此外，TNFR信号途径也受到所在细胞类型、其他信号转导途径、遗传与环境因素等多方面的影响。

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