GID/CTLH 复合体的研究进展

张秀飞李清平孙雯雯陈 新王璐文赵庆臻

(聊城大学生命科学学院,山东 聊城 252059)

0 引言

酵母中的葡萄糖诱导降解缺陷(glucose induced deficient,GID)复合体是由多个亚基组成的高分子量蛋白复合体,它能够帮助细胞快速应对微环境中营养状态的改变,在单细胞酵母糖类代谢途径调控中发挥重要作用[1];哺乳动物中也存在着一种在进化上与酵母GID 复合体同源的CTLH(Carboxy-terminal to Lis H)复合体,该复合体的命名来源于其多个组成亚基中大都含有CTLH 结构域[2]。这两类高分子量的蛋白复合体在进化上具有同源关系,尽管对于此类蛋白复合体的研究仍处于起步阶段,但现有的研究结果已证明其具有独特的作用方式和极其重要的生物学功能。

1 存在于GID/CTLH 复合体蛋白亚基中主要结构域

保守的蛋白质基序或结构域通常意味着蛋白质具有特定的功能特征。CTLH 复合体是一个稳定的多亚基复合体,其亚基成员由多个结构域组成,其中常见的结构域包括Lis H(LIS1-homology,Lis H)、CTLH、CRA 等。酵母GID 复合体和哺乳动物CTLH 复合体分别由7个和8个亚基组成,其中各有5个核心亚基且均具有Lis H 和CTLH 结构域,这也是CTLH 复合体名称的由来原因。具有Lis H-CTLH 结构域的亚基中,大部分成员同时还包含CRA 结构域;此外,在不同亚基中还分别存在SPRY、ARM 和RING 等结构域。具体情况见表1。

表1 GID/CTLH 复合体的亚基及其结构域组成(修改自[13]及[20])

LIS1-同源性(LIS1-homology,Lis H)区域,最初发现于影响人神经元迁移过程的LIS1蛋白。Lis1序列在不同生物中高度保守,其中由第1～39氨基酸残基组成的N 端部分即为Lis H 基序[3,4],目前已知Lis H基序存在于100多种真核蛋白中,一般包含35个氨基酸左右[4];研究发现含有Lis H 基序蛋白质的一般特征是二聚作用,而且依赖Lis H 的二聚化是包含此结构域蛋白质的共同特征[4-6];同时Lis H 二聚化对蛋白质功能非常重要,二聚化功能缺失会影响蛋白质的半衰期和定位[7]。而且由Lis H 起始的二聚化是形成蛋白质多聚体的必须条件[8,9];Lis H 基序还有可能通过影响蛋白质二聚化或其他一些过程从而调节微管的动态变化和细胞迁移[3]。CTLH 一般位于Lis H 的C端,大约由60个氨基酸组成,其结构域以α-螺旋区为主,结构预测表明其中包括三个被短环隔开的α-螺旋。CTLH 结构域一般是与Lis H 共同存在于同一个蛋白中,但也有个别情况下单独出现;多种蛋白质中包含CTLH 结构域,其中一些与微管动力学、核分裂、细胞迁移和染色体分离有关[10]。

CRA(CT11-RanBPM)结构域最初是在人RanBPM 蛋白中鉴定出的一个新结构域,位于RanBPM 的C末端区域,由大约100个氨基酸组成,此区域具有很强的螺旋化倾向,共形成约六个α-螺旋结构。研究表明,Ran BPM 正是通过其C末端的CRA 结构域与其互作蛋白FMTP的相互作用,因此CRA 也具有识别其他蛋白并实现蛋白-蛋白相互作用的功能[10,11]。

RING(Really interesting new gene)结构域是RING 类型泛素连接酶特有的结构域,一般包含40-60 个氨基酸,其中的8个保守的半胱氨酸(Cys)和组氨酸(His)残基与两个Zn2＋离子结合从而维持住一个独特的交叉支撑结构;根据这8个关键氨基酸位点的组成,又将RING 结构域分为C3H2C3及C3HC4两大类型。GID/CTLH 复合体中的少数亚基成员具有RING 结构域,该复合体也已被证明确实具有泛素连接酶活性。

GID/CTLH 复合体由多个亚基组成,而这些亚基也基本上各自包含多种结构域,这个特征也暗示该复合体具有多方面的生物学功能。虽然目前关于GID/CTLH 复合体的生物学功能的研究尚处于初步阶段,但已有结果已表明其参与细胞内多个重要生理生化途径的调节,这也与该复合体多亚基及多结构域的特征相一致。

2 不同生物中GID/CTLH 复合体的亚基组成

2.1 酵母GID/CTLH 复合体的组成

当酿酒酵母细胞从非发酵碳源转移到含有足量葡萄糖的培养基环境中时,糖异生关键酶果糖-1,6-二磷酸酶(Fbp1)会发生快速的代谢降解,以关闭糖异生途径[1,12-14]。本世纪初,德国Wolf实验室通过筛选对葡萄糖诱导的Fbp1代谢降解缺陷(glucose induced deficient,GID)的酵母突变体,先后共找到9个GID 相关基因,分别命名为GID1-9[15,16]。随后对这些基因的功能分析发现,GID3是泛素耦合酶UBC8p[16],GID6是去泛素化酶Ubp14p[15];其余七个GID 蛋白则同属于一个蛋白复合体即GID 复合体。因此GID 复合体至少由七个亚基组成[1],在细胞内进行糖异生反应状态下,GID 复合体由除GID4之外的其余6个亚基组成,当有足够的葡萄糖可供酵母细胞利用时,作为诱导亚基的GID4结合到复合体上,从而引发GID 复合体的泛素连接酶E3活性,使得Fbp1等糖异生关键酶发生泛素化降解[1,17],从而快速关闭糖异生途径,保证酵母细胞能够经济有效地利用碳源和能量物质。

2.2 动植物GID/CTLH 复合体的组成

GID 复合体和哺乳动物中高分子量蛋白复合体CTLH 复合体的蛋白质亚基成分存在于真核生物的多个谱系中,说明它们起源于真核生物共同的祖先[10]。在细胞质和细胞核中广泛定位的CTLH 复合体就是酵母GID 复合体的同源物,七种酵母GID 蛋白在人体CTLH 复合体亚基中均有同源蛋白,但相对于单细胞真核生物酵母来说,酵母中的单基因在人中又进化成两个高度同源的不同基因,如GID1在人类体内已经进化成两个高度同源的不同基因RanBP9(Ranbpm)和RanBP10(又称Scorpins)[18];GID2则对应于人中的RMND5A 和RMND5B[19]。另外,CTLH 复合体中的YPEL5亚基与酵母Moh1同源,但后者被认为并不是酵母GID 复合体的必须亚基[20]。具体见表1。

植物由于其固着生长的特性,不能像动物通过改变位置来躲避恶劣环境,因此长期进化过程中在植物体内形成了更加精细复杂的基因表达调控系统,以帮助植物体尽量适应复杂多变的环境条件,因此相对于酵母和动物,在植物体内往往存在更多数目的同源基因,同时也使得植物中有更多的基因冗余现象,GID/CTLH复合体的亚基在植物体内的同源基因亦是如此。到目前为止,还没有任何有关在植物体内GID/CTLH 完整复合体的报道,但进化关系分析表明GID/CTLH 复合体的绝大多数亚基在模式植物拟南芥体内都具有更多数目的同源基因[10]。

3 GID/CTLH 复合体是有功能的泛素连接酶

3.1 泛素26S蛋白酶体系统及泛素连接酶

泛素26S蛋白酶体系统(ubiquitin 26S proteasome system,UPS)是所有真核生物体内具有的高度选择性的蛋白质降解途径,其中泛素化修饰是底物蛋白被送入26S蛋白酶体中降解的前提条件。哺乳动物中通过26S蛋白酶体降解约80%的多泛素化蛋白包括异常蛋白质以及大量的调节蛋白等,因此UPS在真核细胞内参与各种生理生化途径及信号通路的调控[21-23]。泛素(ubiquitin,Ub)是一种只有76个氨基酸的小蛋白,泛素共价连接到底物蛋白上(主要结合位点是赖氨酸侧链的氨基)称为蛋白质的泛素化修饰,该过程是通过泛素激活酶E1(ubiquitin-activating-enzyme)、泛素耦合酶E2(ubiquitin-conjugating-enzyme)和泛素连接酶E3(ubiquitin ligase)的依次级联反应完成[23];蛋白质的泛素化修饰有不同的立体构型,E2在这方面具有很大的影响作用,而E3主要负责底物蛋白的特异性[24],特定的E2-E3组合能够调控特定的底物蛋白发生特定类型的泛素化修饰,从而决定底物蛋白的命运[25]。

目前已知人体中大约有600种不同的E3泛素连接酶,负责将短寿命的调控蛋白、异常蛋白等送入26S蛋白酶体中降解[26]。E3 蛋白的活性结构域主要包括两大类型:HECT(homolog to E6-AP C terminal,HECT)和RING(Really interesting new genes,RING)[27]。具有HECT 结构域的E3首先接受来自于E2-Ub中间体的泛素分子,然后再将泛素转移到底物蛋白上;RING 类型E3则不直接结合泛素,而是帮助E2将泛素转移到底物上,其中的RING 域负责与E2 结合并刺激泛素转移。RING 结构域采用具有两个Zn2＋离子的保守交叉支撑结构,可以是单体或二聚体,二聚化由RING 结构域单独或由侧翼螺旋区域促进。另外还有与经典的RING 结构域很相似但又有所不同的U box及Ring变异体(RING variants,RINGv)[28]以及较晚发现的RBR 结构域等。

3.2 GID/CTLH 复合体具有E3泛素连接酶活性

根据亚基组成,E3泛素连接酶分为单亚基E3和多亚基E3。常见的单亚基E3有HECT 类型E3和RING 类型E3,多亚基E3有SCF类E3、BTB类E3、DDB类E3以及APC类E3;而这几种多亚基E3中均包括具有RING 结构域的亚基成员[29]。GID/CTLH 复合体虽然也是由多个亚基组成的蛋白复合体行使E3功能,而且GID 复合体的GID2和GID9及CTLH 复合体中RMND5A 和MAGA 亚基都具有RING 结构域[1,10,30,31],但其的其他亚基组成与SCF、BTB、DDB及APC类E3大不相同,是比较特殊的一类蛋白复合体类E3。另外,虽然CTLH 复合体与酵母GID 复合体在进化上同源,但作为E3泛素连接酶,这二者在底物特异性上又大不相同。GID 复合体能够泛素化糖异生酶,如果糖-1,6-二磷酸酯酶(Fbp1),磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pck1)和苹果酸脱氢酶(Mdh2),调控它们泛素化降解[1,12],从而保证酵母细胞在不同碳源环境下快速启动或关闭糖异生途径。而目前已知在人类细胞中与CTLH 复合体参与的泛素化降解相关的底物蛋白有该复合体自身组成亚基之一Muskelin[31]和细胞增殖相关转录因子Hbp1[19]。这二者均不是糖异生途径调节酶,这种底物特异性的差别可能与多细胞复杂有机体与单细胞酵母生理特性的区别有关。最新研究发现,人类GID 复合体(hGID)即CTLH 复合体具有两种不同的底物识别模块,分别依赖WDR26和GID4。在体外条件下,WDR26与RanBP9共同作用将Hbp1泛素化,此过程不需要GID4;而对另一个底物ZMYND19的识别中则需要GID4的参与,令人惊奇的是ZMYND19并不具有Pro/N-末端规则的特征[32]。随着研究的深入,相信会有更多的CTLH 复合体的泛素化修饰底物被发现,从而帮助我们更加深入地理解CTLH 复合体的生理功能及作用机制。

4 GID/CTLH 复合体的功能

目前在原核生物中并未发现GID/CTLH 复合体亚基同源成分[1,2],因此GID/CTLH 复合体应该是真核细胞中特有的,这也与泛素化修饰是真核细胞中特有的翻译后修饰相符合。

4.1 酵母GID复合体的功能

当葡萄糖缺乏时,糖异生途径可以从前体分子合成细胞所需要的葡萄糖,该途径的活性受到严格调控,以避免在有足够葡萄糖存在时,糖异生和糖酵解途径同时运转导致无效ATP水解造成能量浪费[33]。酵母GID 复合体的作用就是在给饥饿细胞补充足够的葡萄糖时,作为E3泛素连接酶快速泛素化细胞内的糖异生途径关键酶,介导它们的蛋白酶体降解,从而快速关闭糖异生途径[1,12,13]。后来发现N 末端Pro及其随后的一段灵活可变的氨基酸序列可以作为GID 复合体底物的识别标志,说明酵母细胞中可能存在一种基于GID的保守的蛋白降解途径,并将其命名为Pro/N-末端规则通路(Pro/N-end rule pathway)[12]。迄今为止酵母中已知的GID 底物仅限于在特定糖环境下的糖异生关键酶,是否存在其他类型的底物目前仍不清楚。

4.2 哺乳动物CTLH 复合体的功能

CTLH 复合体在细胞核与细胞质中均有表达,它能够迅速接收细胞外的不同信号,协调细胞发生可逆的变化,从而适应不断变化的环境。目前CTLH 复合体的研究仍处于初期阶段,复合体中大多数的成分以及功能仍不清楚,但从已知的研究中已发现哺乳动物该复合体的功能涉及细胞内多个不同的生理途径。比如CTLH 复合体成员可以参与智力障碍、神经退化性疾病和人格障碍有关过程[8,13,34],且能调控c-Raf的降解、抑制细胞转化和肿瘤形成[35],并且CTLH 蛋白也可参与特定细胞群和组织发育过程[34,36-38]。例如TWA1是CTLH 复合体中最小的组成蛋白,仅由Lis H、CTLH 和CRA 这三个结构域组成,在真核生物中高度保守,在结构二聚化中发挥重要作用[39];Armc8能够促进肝细胞生长因子调节酪氨酸激酶底物(HRS)与泛素化蛋白相互作用以及调节环蛋白降解[40];MAEA 是红细胞巨噬细胞的附着蛋白,能够在红细胞被挤压时发挥作用;但在非红细胞中,MAEA 则是核蛋白[41];WDR47是真核生物中最大的蛋白家族的成员之一,它在细胞增殖、神经元迁移和纤维束投射中发挥作用,同时WDR47与LIS1结构同源,其突变会导致无脑畸形[42];Muskelin和RanBP9是CTLH 复合物蛋白中研究最详细、功能最清楚的蛋白,Muskelin在细胞内的分布受寡聚状态的调控,并依赖于Lis H 结构域介导的二聚化[43],同时它在细胞形态、转录调节和突触过程中发挥作用[44-46],RanBP9可整合到多种蛋白质复合体中,进而参与信号转导、神经退行性变和精子形成等过程[36,47-49]。

在泛素化修饰的三个关键酶中,E3泛素连接酶主要负责底物蛋白的特异性选择。酵母中GID 复合体的底物是糖异生途径的调节酶,但研究表明人类CTLH 复合体对于糖异生调节酶的泛素化降解并不是必须的[19]。因此,虽然很多代谢途径从细菌到人类均高度相似,但其相关生物学过程以及调控机制由于适应不同生物体的需求而产生了很大区别。目前已明确的被CTLH 复合体识别并泛素化降解的底物是调控很多促生长调节因子基因表达的转录因子Hbp1[19],且在此过程中与CTLH 复合体协同作用的E2-UBC2H,也是酵母GID 复合体协同作用的酵母E2-UBC8/GID3的人类同源基因。另外,还发现CTLH 复合体在体外条件下可以降解其自身亚基之一的Muskelin,说明CTLH 复合体可能具有自身调控功能。但此过程目前仅有体外实验结果,且其中发挥作用的E2是UBE2D1、UBE2D2和UBE2D3而不是UBC2 H,因此Muskelin是否为CTLH 复合体的泛素化降解底物还需要体内实验来确定[31]。目前初步的研究结果已经证实人类CTLH 复合体的生物学功能涉及到多个细胞生理途径,可以推测CTLH 复合体应该有多个/种底物蛋白质,相信随着研究的深入,会有更多的CTLH 复合体的底物蛋白被发现,进而CTLH 复合体调节细胞生理途径的机制也会越来越清晰。

医学领域的研究发现CTLH 复合体的功能与癌症的发生明显相关。CTLH 复合体在人类恶性肿瘤中的整体表达增强中发挥作用,对高增殖和应激性肿瘤细胞也很重要。它在肿瘤细胞发生的早期阶段具有抑瘤作用,但在肿瘤形成以后,这种抗肿瘤功能将变成有利于肿瘤生长[50]。已知癌症细胞的可塑性和适应性是癌症治疗困难的重要障碍[51,52],与各种信号通路相连的大分子复合体非常适合作为细胞可塑性的调节器,因为它们能够快速重塑并改变成员组成,CTLH 复合体正是这样的大分子复合体。由于CTLH 复合体在细胞核和细胞质中均有定位、能够影响其他蛋白的稳定性和亚细胞定位[13,49],同时它与各种信号通路和癌细胞可塑性的基本生物学过程均有联系,且已证明CTLH 复合体基因的过表达影响了癌细胞可塑性[53,54],因此它可以结合不同的细胞外信号和快速可逆调节细胞变化,从而在癌症发生或抑瘤过程中起着重要的调控作用。

4.3 植物中GID/CTLH 复合体同源基因的功能研究进展

目前尚未有植物中GID/CTLH 复合体的相关报道,但已有少数与GID/CTLH 复合体亚基同源的植物基因功能的分析结果。RanBPM(RanBP9)最初是作为人类细胞中与中心体相关蛋白被报道的,基于序列的相似性,找到了人类RanBPM 在拟南芥中的同源物AtRanBPM,发现AtRanBPM 主要存在于细胞质中一个分子量约230-500 k Da的蛋白复合体中,AtRanBPM 具有高度保守的SPRY、Lis H、CTLH、CRA 结构域利用IP-MS方法鉴定出多种At RanBPM 的相互作用蛋白,它们也是包含有Lis H、CRA、RING-U-box等结构域,且这些蛋白在酵母及人中的同源物都是GID/CTLH 复合体的组成亚基[55],因此这个包含有At RanBPM 的大分子量复合体很有可能是植物中的GID/CTLH 复合体。WD repeat蛋白At WDS1定位于细胞核中,它能够与At RanBPM 相互作用,且At RanBPM 基因突变会导致At WDS1部分定位于细胞质。研究表明At WDS1是一种新的氧化还原稳态调节因子,能够通过响应发育和胁迫信号来调节叶片衰老的过程[56]。

除了At RanBPM 及At WDS1这种与GID/CTLH 亚基同源的基因,还有一些虽不与GID/CTLH 亚基同源但同样具有SPRY、Lis H、CTLH 或CRA 结构域的植物基因。拟南芥中对于激素信号和发育过程有重要调控作用的转录共抑制因子TOPLESS(TPL)蛋白中就包含Lis H、CTLH 和CRA 结构域,相对于哺乳动物同源蛋白TBL1,植物TPL 演化出了新的蛋白四聚化界面以及一个独特的结合抑制因子的表面,且这二者的作用是相互依赖的[57,58]。共生受体激酶Sym RK 是根瘤菌感染豆科植物引起根毛形态改变必需的,与SymRK 相互作用的E3泛素连接酶(SIE3)可以结合并泛素化SymRK,而SIE3中包含保守的CTLH、CRA和RING 结构域,是一类新的植物特异性E3连接酶,而且在荷花和豆科植物中均检测到SIE3蛋白参与根瘤菌的感染与结瘤[59]。目前本领域在植物中的研究还处于非常初步的阶段,相信随着研究的深入,会有更多相关内容的分析和报道。

5 展望

酵母GID 复合体的功能主要集中在糖异生途径的调控,它是酵母细胞能够经济高效地利用能量以快速对环境营养条件做出响应的高度保障机制;但该复合体是否还影响糖异生途径之外的生理生化途径,目前还未可知,有待进一步研究;虽然人CTLH 复合体的拓扑结构与酵母GID 复合体在进化上高度保守,但已有结果显示CTLH 复合体似乎并不影响糖异生关键酶Fbp1的蛋白降解,可见人中CTLH 复合体的生物学功能与酵母GID 复合体已有明显不同,这应该与多细胞复杂生物体中发生的基因重复及进化最终影响到更多的生理途径有关;目前对动物及人中CTLH 复合体的研究还处于非常初步的阶段,但已知CTLH 复合体与多种致癌信号通路都有潜在联系,说明它具有整合和协调细胞外信号的能力,因此CTLH 复合体的生物学功能及其在肿瘤发生中的作用机制可能成为未来研究的重点。另外,已有结果表明该复合体对细胞中多种生理生化途径均具有强大调控功能,因此分析该复合体不同亚基的作用方式和机理,以及所有亚基结合起来作为一个完整的蛋白复合体的生物学功能,都值得我们进行深入探究和解析,目前发展飞速的多种组学分析手段更可以为这种复合体的功能解析助力。目前植物中还未有与GID/CTLH 复合体同源复合体的报道,但有同源亚基的存在,暗示植物中也存在这种复合体,且也有可能参与细胞内多个生物学途径的调控,这也将会是植物学领域中新生的研究方向和热点之一。