亚临界水提取大豆胚芽中异黄酮及低聚糖的研究

王凤荣 宋秀梅 张博雅 张永忠，2

亚临界水提取大豆胚芽中异黄酮及低聚糖的研究

王凤荣1宋秀梅1张博雅1张永忠1，2

(东北农业大学理学院1，哈尔滨 150030)
(教育部大豆生物学重点实验室2，哈尔滨 150030)

以大豆胚芽为原料、高压反应釜为反应容器，应用亚临界水为溶剂、采用高纯氮气加压提取大豆胚芽中异黄酮及大豆低聚糖。利用紫外分光光度法测定大豆异黄酮的含量。选取液料比、提取时间、提取温度、压力4个因素进行单因素试验，再进行正交试验优化亚临界水提取大豆异黄酮的条件。结果表明:在液料比25∶1，浸提温度120℃，浸提时间40 min，浸提压力1．9 MPa的条件下，大豆异黄酮的得率是1．09%，大豆异黄酮粗提物的产率为6．52%，粗提物纯度是2．60%;大豆低聚糖粗提物产率是35．2%。

亚临界水 大豆胚芽 异黄酮 大豆低聚糖

12种大豆异黄酮中的染料木黄酮(genistein)和黄豆苷元(daidzein)具有多种生物活性和生理功能。美国国家癌症研究所于1996年已将染料木黄酮列入肿瘤化学预防药物临床发展计划之中，主要预防目标是乳腺癌和前列腺癌［1］。它能抗氧化、消炎，有弱雌激素活性，能有效地预防和抑制各种肿瘤、骨质疏松症、妇女更年期综合症及心血管疾病等多种疾病的发生［2］。染料木黄酮在药用机制方面具有不杀伤正常细胞的特点［3］，这在现有抗癌药物中实属罕见，因而受到各国医药界的关注。国外一直应用染料木黄酮进行临床试验研究［4－7］。国外对黄豆苷元的研究也取得了重要进展。2010年伯克康奈尔医学研究所、纽约亨特学院生物系，密歇根大学医学院等发表了对黄豆苷元进行临床试验研究的重要成果。这几所研究机构对一个含有2 000种FDA许可使用的药物，天然产物和其它生物活性化合物的药物库中的化合物进行筛选，结果表明黄豆苷元可通过非c AMP依赖途径促进神经元的保护和再生，这一发现有望使它成为预防中风和治疗帕金森病的安全药物［8］。

当水在374．2℃和22．1 MPa以上的高温、高压条件下，可形成既非液体又非气体的第4状态，即所谓“超临界状态”。在此状态下的水称为“超临界水”。在稍微低于此温度和压力下的水称为“亚临界水”［9］。研究表明，亚临界流体物理、化学特性的改变主要源于介电常数的改变［10］。水的介电常数随着温度升高而降低，水在250℃时介电常数为27［11］，介于常温常压下乙醇(介电常数24)和甲醇(介电常数33)之间，由此可见通过升高亚临界水的温度可以改变水的极性、增加扩散力、提高溶解度、降低黏度、降低表面张力、降低物理/化学结合力，从而提高其对中极性和非极性有机物的溶解能力，加快大豆异黄酮在亚临界水中溶解的化学进程。升高压力有利于水进入低压时封闭的微孔，同时使水在高温下仍保持液态并快速充满萃取池，采用高纯氮气加压可以防止提取过程中高温下异黄酮被氧化，提高大豆异黄酮的得率。

大豆胚芽是豆制品工业的副产物之一。大豆异黄酮在大豆胚芽中的含量远高于大豆子叶和种皮中的含量，一般高出8～10倍。利用大豆胚芽为原料可以降低大豆异黄酮的生产成本。大豆胚芽中还含有较多的大豆低聚糖。大豆低聚糖是多羟基的醛或酮，可溶于水。在低聚糖水溶液中加入乙醇会破坏低聚糖与水形成的氢键，从而降低低聚糖在水中的溶解度，使低聚糖以沉淀的形式析出［12］。利用低聚糖溶于水而不溶于高浓度乙醇的性质可使低聚糖沉淀出来得到大豆低聚糖粗提物［13］。分离亚临界水浸提液中的大豆低聚糖，可以起到纯化大豆异黄酮的作用。应用亚临界水为溶剂、采用高纯氮气加压提取大豆胚芽中异黄酮及大豆低聚糖的研究在国内还鲜有报道。本研究以亚临界水为溶剂，应用高纯氮气加压，以大豆总异黄酮得率为指标，应用单因素和正交设计试验优化提取大豆异黄酮的工艺条件;再应用醇沉法从提取液中分离出大豆低聚糖，建立了提取大豆异黄酮和大豆低聚糖的综合工艺。

1 材料与方法

1．1 材料、试剂

大豆胚芽:哈高科大豆食品有限责任公司;染料木苷(Genistin)标准品:Sigma公司，质量分数为98．0%;高纯氮气:北京亚南气体有限公司，质量分数为99．999%;其他试剂均为分析纯。

1．2 试验仪器

索氏提取器;高压磁力搅拌反应釜:烟台高新区科立自控设备研究所;LG10－2．4A型高速离心机;TU－1901双光束紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司。

1．3 试验方法

1．3．1 原料处理

将大豆胚芽粉进行索氏脱脂7～8 h，脱脂后置于表面皿上自然干燥后备用。

1．3．2 亚临界水法提取大豆异黄酮

将上述脱脂后的胚芽放入高压反应釜中，加入一定体积的蒸馏水，通入高纯氮气加压，在磁力搅拌转速为180 r/min下，一定的提取温度下提取一定时间，得到提取液用热水漏斗趁热过滤。吸取一定量滤液用95%乙醇进行定容稀释到一定倍数后待测。

以染料木苷为标准品，在240～280 nm采用三波长紫外分光光度法［14］绘制标准曲线，得到A=0．427 3 x+0．002 6(R2=0．999 8)方程，式中 A 为吸光值，x为质量浓度(μg/mL)。以上述待测液在特征吸收区吸收的强弱定量测定，计算大豆异黄酮的得率。

1．3．3 大豆异黄酮与大豆低聚糖的分离

应用1．3．2得到的最佳工艺条件提取大豆异黄酮。首先将应用高压反应釜提取后得到的浸提液经热水漏斗过滤，除去杂质。然后将滤液减压浓缩、冷却后搅拌下加入无水乙醇使大豆低聚糖沉淀，经布氏漏斗减压过滤得大豆低聚糖产品。滤液水浴45℃下减压蒸馏除去乙醇得到异黄酮浓缩液，再减压真空干燥得到大豆异黄酮粗产品。

2 结果与分析

2．1 单因素试验

2．1．1 液料比对大豆异黄酮得率的影响

在提取温度110℃，提取时间30 min，反应釜内浸提压力为0．1 MPa条件下，每个条件做3次重复试验，考察亚临界条件下液料比对大豆异黄酮得率的影响，结果见图1。

图1 液料比对大豆异黄酮得率的影响

由图1可知，液料比与大豆异黄酮得率呈正相关，在液料比为30∶1的情况下，得率达到最高。原因是液料比过小，会出现糊底现象，容易使浸出的异黄酮黏在反应釜内壁上，不易转移，易造成产品损失。应用SPSS软件得到的方差分析和多种比较结果表明，液料比为30∶1与35∶1两处理间的差异达不到统计学意义的显著水平，分别和 15∶1、20∶1、25∶1 三处理间的差异达到统计意义的显著水平。可得，随着液料比增大，大豆异黄酮得率增加。但大豆异黄酮总量是一定的，当液料比继续增大到35∶1，不能增加得率，而且后续脱溶会浪费大量能源，不利于工业化生产。故选25∶1、30∶1、35∶1 共3 个水平作正交试验。

2．1．2 提取时间对大豆异黄酮得率的影响

在提取温度110℃，液料比30∶1，浸提压力为0．1 MPa条件下，每个条件做3次重复试验，考察亚临界条件下提取时间对大豆异黄酮得率的影响。结果见图2。

由图2可知，时间与大豆异黄酮得率呈正相关，随着提取时间的延长，大豆异黄酮得率迅速提高，30 min时达到最大值，此后缓慢下降。原因可能是原料或提取液中的异黄酮与高温壁接触的时间越长会导致大豆异黄酮部分分解。方差分析和多种比较结果表明，时间10、20 min两处理间和30、40、50 min 3处理间都达不到统计学意义的显著水平，但这两组间达到统计学意义的显著水平。故选择20、30、40 min 3个水平作正交试验。

图2 提取时间对大豆异黄酮得率的影响

2．1．3 提取温度对大豆异黄酮的得率影响

在提取时间30 min，液料比30∶1，浸提压力为0．1 MPa条件下，每个条件做3次重复试验，考察亚临界条件下提取温度对大豆异黄酮得率的影响。结果见图3。

图3 提取温度对大豆异黄酮的得率影响

由图3可知，大豆异黄酮的得率随着温度的升高而迅速增加，在110℃时达到最高，120℃时增加不明显，大于120℃时得率明显下降。原因可能是当温度低于100℃水还不是亚临界水，对弱极性的异黄酮溶解能力较小。当温度高于120℃时，部分异黄酮可能被分解。方差分析和多种比较结果表明，110、120℃两处理间与130、140℃两处理间均达不到统计学意义上的显著水平，100℃与110、120℃能达到统计学意义的显著水平。故选100、110、120℃3个水平作正交试验。

2．1．4 提取压力对大豆异黄酮的得率影响

在提取温度为110℃，时间30 min，液料比为30∶1的条件下，每个条件做3次重复试验，考察亚临界条件下压力对大豆异黄酮得率的影响。结果见图4。

图4 提取压力对异黄酮得率的影响

由图4可知，大豆异黄酮的得率随着压力的升高而增大，且在反应釜内浸提压力为1．5 MPa时达到最大值，升高压力有利于溶剂进入低压时封闭的微孔，同时使溶剂在高温下仍保持液态。方差分析和多种比较结果表明，1．5 MPa 分别与 1．1、1．9 MPa达到统计学意义的显著水平，0．3、0．7、1．1 MPa 3 处理间未达到统计学意义的显著水平。故选择1．1、1．5、1．9 MPa 3 个水平作正交试验。

2．2 二次回归正交旋转组合设计试验

在单因素试验的基础上，对影响大豆异黄酮提取物得率的因素进行L9(34)正交试验，因素水平见表1，试验结果见表2。

由表2可见，影响大豆异黄酮的因素主要次序为A＞C＞D＞B，其中液料比和温度对得率影响显著，最佳组合为A1B3C3D3，即液料比25∶1，浸提时间为40 min，浸提温度120℃，浸提压力1．9 MPa。

表1 因素水平表

表2 正交试验结果

2．3 与醇提法对比试验结果

由表3可知，与醇提法相比，亚临界水法提取大豆胚芽中的异黄酮得率明显提高，而且提取时间大大缩短。另外亚临界水法用的溶剂是水，绿色环保、成本低。说明采用亚临界水法提取大豆胚芽中的异黄酮节能省时，有利于工业化生产。

表3 对比试验结果

2．4 异黄酮与低聚糖的分离及验证试验

按正交试验确定的最佳条件进行平行验证试验3次。取大豆胚芽8．000 g，脱脂后以25∶1的液料比放入高压反应釜内，通入高纯氮气使压力达到1．9 MPa，在温度120℃下提取40 min。得到的浸提液经热水漏斗过滤，除去杂质。将滤液减压浓缩约至10 mL，冷却后搅拌下加入190 mL无水乙醇得到大豆低聚糖沉淀。经布氏漏斗减压过滤得大豆低聚糖产品，真空干燥后称得产品2．819 4 g，大豆低聚糖的粗提物产率为35．2%，滤液在45℃下减压蒸馏除去乙醇得到异黄酮浓缩液，再减压真空干燥得到大豆异黄酮粗产品0．521 7 g，产率为6．52%，粗产品纯度为2．60%。

3 结论

通过单因素试验和正交试验确定亚临界水法提取大豆异黄酮的最优条件为:液料比25∶1，浸提时间40 min，浸提温度120℃，浸提压力1．9 MPa。应用亚临界水为溶剂、采用高纯氮气加压提取大豆胚芽中异黄酮及低聚糖在最佳条件下大豆异黄酮的得率为1．09%，异黄酮的粗提物产率为6．52%，纯度为2．60%，大豆低聚糖粗提物产率为35．2%。

［1］Kelloff GJ，Crowell JA，Boone CW，et al．Strategy and planning for chemo preventive drug development:clinical development plansⅡ［J］．Journal of Cellular Bioch，2004，56(S20):55－62

［2］Richard A Dixon，Daneel Ferreira．Genistein［J］，Phytochemistry，2002，60(3):205－211

［3］Rao CV，Wang C．XSimi B，et al．Enhancement of experimental colon cancer by genistein ［S］．Cancer Res，1997，57:3717－3724

［4］Clarissa S．Craft．Genistein induces phenotypic reversion of endoglin deficiency in human prostates cancer cells．［J］．Molecular Pharmacology，2008，73:235－244

［5］Shahana Majid．Genistein induces the P21WAF1C1P1 and P16 INK4a Tumor suppressor Genes in Prostate Cancer cell by Epigenetic mecha-nisms Involving Active chromatin Modification［J］．Cancer Res，2008;68:(8):2736－ 2744

［6］Noei J．M．Antileukemic Activity of Genistein，A major isoflavone present in soy products［J］．Net．prod，2008，71:3－7

［7］Eric M Vela，Gavin C Bowick，Norberk K Herzog，et al．Genistein treatment of cells inhibits arenavius infection［J］．Antiviral Research，77(2008):153－156

［8］Thong C Ma，Aline Campana，Philipp S Lange，et al．A large－scal chemical screen for regulators of the arginase 1 promoter identifies the soy isoflavone daidzein as a clinically approved small molecule that can promote neuronal protection or regeneration via a cAMP－ Independent pathway［J］．The Journal Neuroscience，2010，30(2):739－748

［9］盛国华．亚临界水提取技术在有效利用食品副产物中的应用［J］．中国食品添加剂，2009(2):127－129

［10］Yamaguchi Toshio．Structure of subcritical and supercritical hydrogen － bonded liquids and solutions［J］．Journal of Molecular Liquids，1998，78:43－50

［11］吴仁铭．亚临界水萃取在分析化学中的应用［J］．化学进展，2002，14(1):32－36

［12］张丽丽，张永忠．醇沉法分离大豆糖蜜中大豆低聚糖的研究［J］．中国油脂，2009，34(4):47－49

［13］李宏燕，樊君．大枣多糖的水提醇沉工艺研究［J］．宁夏工程技术，2005，4(3):265－267

［14］魏福华，张永忠，井乐刚，等．紫外分光光度法测定大豆中大豆异黄酮［J］．理化检验:化学分册，2006，42(6):461－463

［15］朱梅，信维苹．大豆胚芽异黄酮的提取及对食品抗氧化作用的研究［J］．北华大学学报，2008，9(4):327－330．

Study on Sub－critical Water Extraction of Isoflavones and Soybean Oligosaccharides from Soybean Germ

Wang Fengrong1Song Xiumei1Zhang Boya1Zhang Yongzhong1，2
(College of Science，Northeast Agricultural University1，Harbin 150030)
(Key Laboratory of Soybean Biology，Ministry of Education2，Harbin 150030)

The native potato starch was carboxymethylated through microwave radiation Tech－nology．Based on single factor experiments，a series of central composite design experiments were conducted for an optimal synthesis process．CH2ClCOOH，NaOH，time of etherification and ethanol concentration were selected as variables and a mathematical regression model for degree of substitution was developed．Finally，the optimal extraction process was obtained as follows:etherification time 25 min，ethanol concentration 83．86%，nClCH2COOH∶nAGU=0．768∶1，and nNaOH∶nAGU=2．597∶1．Under such conditions，the DSwas up to 0．325．

carboxymethylation，potato starch，microwave，response surface methodology

A

1003－0174(2011)11－0032－05

863计划(2008AA10Z331)

2011－02－24

王凤荣，女，1986年出生，硕士，食品化学与营养

张永忠，男，1953年出生，教授，硕士生导师，应用化学