纳豆芽孢杆菌发酵产蛋白酶工艺优化

潘进权

纳豆芽孢杆菌发酵产蛋白酶工艺优化

潘进权

(湛江师范学院生命科学与技术学院，湛江 524048)

纳豆芽孢杆菌是纳豆发酵生产的主要菌种，对其发酵产蛋白酶特性的探讨将有助于了解纳豆的发酵生产过程，为其提供理论指导。从不同纳豆产品中分离筛选得到一株高产蛋白酶的纳豆芽孢杆菌，采用响应面设计的方法对影响其发酵产酶的若干因素进行了分析，确定了相对较稳定的发酵培养基及工艺条件:可溶性淀粉 3．41%，麸皮 2%，黄豆粉2．26%，CaCl20．2%，K2HPO40．24%，Tween 80 0．2%，pH 8．0 ～8．5;发酵温度35～38℃，时间70 h。在优化的培养基及条件下，该菌种蛋白酶的发酵单位可以达到7 200 U/mL，较优化前提高了约2倍。

纳豆芽孢杆菌 蛋白酶 发酵工艺 优化 响应面法

纳豆是一种传统的大豆发酵食品，具有很好的保健及食疗价值，这主要与该产品中纳豆芽孢杆菌的益生作用、大豆异黄酮、活性多肽及纳豆激酶等有密切的关系［1－2］。纳豆芽孢杆菌是用于纳豆发酵生产的主要菌种，属于细菌科芽孢杆菌属，其原始菌株与枯草芽孢杆菌相同，是枯草芽孢杆菌的一个亚种。在纳豆的发酵生产中该菌可以分泌多种胞外酶，包括有淀粉酶、脂肪酶、纳豆激酶及多种蛋白酶等［3］。这些酶的共同作用赋予了纳豆产品特有的风味，以及产品的保健价值。因此对这些酶的研究将有助于了解纳豆的发酵工艺过程，对发酵生产给予理论指导，同时也可从中发掘一些有应用价值的新酶。虽然纳豆的发酵生产有悠久的历史，但是对该菌种胞外酶系的研究却相对较少，主要的研究工作集中于该菌种益生作用的探讨［4－7］，纳豆激酶［8－10］的研究与开发等。然而，对该菌种胞外蛋白酶的研究却相对较少，仅有少数学者对该菌种的发酵产酶特性进行过探讨［11－13］，而对于其胞外蛋白酶的组分构成及其催化特性却鲜见报道。为了探讨纳豆芽孢杆菌胞外蛋白酶在纳豆发酵生产中的作用，课题组将对纳豆芽孢杆菌胞外蛋白酶系的特性进行探讨。在前期工作中，从各种纳豆产品中分离筛选得到了一株具有蛋白酶高产特性的纳豆芽孢杆菌，探讨其发酵特性，为后续酶的分离纯化及性质研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto sp．):实验室分离保藏菌种。

斜面活化培养基:0．5%葡萄糖，0．5%牛肉膏，1．0% 蛋白胨，0．5%NaCl，1．5% 琼脂，pH 7．0。液体种子培养基:葡萄糖2%，蛋白胨 1%，牛肉膏0．5%，NaCl 0．5%，Tween 80 0．1%，pH 7．0。基础发酵培养基:蔗糖2%，大豆蛋白胨1%，硫酸铵0．5%，Na2HPO40．1%，NaH2PO40．1%，CaCl20．02%，MgSO40．1%，pH 7．0。

UV－2000型分光光度计:尤尼柯上海仪器公司;SC－A型精密恒温水浴锅:宁波莱福公司;SPX－250B－Z型生化培养箱:上海博讯实业有限公司;HYQ45型全温摇床:武汉汇诚生物科技有限公司。

1．2 试验方法

1．2．1 种子活化

菌株经斜面活化后，接种一环于装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，在37℃，200 r/min的摇床上培养24 h。

1．2．2 发酵方法

每个250 mL三角瓶中装入50 mL发酵培养基，灭菌冷却后接种2 mL活化的液体种子，置于全温摇床于37℃，培养72 h。

1．2．3 单因素试验

分别以3%的碳源(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、玉米粉、麸皮)，2%的氮源(蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NaNO3、(NH4)2SO4、黄豆粉)，0．1% 无机盐(MgCl2、CaCl2、ZnSO4、KH2PO4、K2HPO4)和 0．05%无机盐(FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O)代替基础发酵培养基中的碳源、氮源和无机盐，并添加 0．1%Tween 80或Tween 20，其他成分保持不变，进行发酵试验筛选碳源、氮源和无机盐及表面活性剂。以此确定对纳豆芽孢杆菌发酵产酶有促进作用的营养成分。

1．2．4 部分析因设计

利用Minitab统计软件，采用其中的2水平试验设计，对上述单因素试验筛选到的因素做进一步的分析，以确定对纳豆芽孢杆菌发酵产酶有显著作用的因素，并初步考察各因素间的交互作用。

1．2．5 响应面设计

利用SAS统计软件，采用响应面分析法中的中心组合设计［14］，对部分析因设计中筛选的因素做进一步考察，以确定其最合适的取值，并由此确定发酵培养基的组成。

1．2．6 pH对纳豆芽孢杆菌发酵产酶的影响

采用优化后的发酵培养基，分别调节其起始酸碱度到不同 pH(5．0 ～10．0)，按照 1．2．2 的方法进行发酵试验，考察了培养基起始pH对纳豆芽孢杆菌发酵产酶的影响。

1．2．7 温度对纳豆芽孢杆菌发酵产酶的影响

采用优化后的发酵培养基，调节其起始pH到8．0，按照1．2．2 的方法分别在不同温度(25 ～45 ℃)下进行发酵试验，考察了发酵温度对纳豆芽孢杆菌产酶的影响。

1．2．8 发酵时间与纳豆芽孢杆菌产酶的关系

采用优化后的发酵培养基，调节其起始pH到8．0，按照1．2．2 的方法在 35 ℃下进行发酵试验，考察发酵时间与纳豆杆菌产蛋白酶的关系

1．2．9 蛋白酶活性测定

采用 Folin 酚法［15］:1．5 mL 离心管中加入 0．3 mL稀释的发酵液及0．3 mL 1．5%酪蛋白(溶于0．05 mol/L pH 7．5 的缓冲液)，40 ℃ 反应 10 min，加0．6 mL 0．4 mo1/L的三氯乙酸终止反应，静置15 min后14 000×g离心10 min，取上清液 0．6 mL，加入3 mL 0．4 mol/L碳酸钠溶液及 0．6 mL福林酚试剂，于40℃显色20 min，于680 nm测定其吸光值，根据标准曲线计算酶活单位。

酶活定义:试验条件下，每分钟水解酪蛋白释放出1μg当量酪氨酸所需的酶量为1个活力单位。

2 结果与讨论

2．1 发酵培养基优化

2．1．1 单因素试验

纳豆芽孢杆菌利用各种碳源、氮源及无机盐发酵产酶的效果有所不同。相比而言，在试验的几种碳源中，可溶性淀粉及麸皮发酵产酶的单位最高，这与枯草芽孢杆菌发酵产酶的特点相似［16］。分析其原因，这可能与该菌的发酵产酸有关。用淀粉类碳源时，由于碳源利用速率相对较缓慢，发酵产酸较少，不会导致酸的积累而使pH大幅度下降;而用其他糖作为碳源时产酸速度较快，pH明显下降，从而在一定程度上影响了酶的合成。在供试的6种氮源中，无机氮源对发酵产酶有显著的抑制作用，单纯用无机氮源时该菌种基本上不具有产酶的能力;相比而言，有机氮源比较有利于发酵产酶，这应该与蛋白酶的诱导表达特性有关系;在有机氮源中，以黄豆粉的效果最佳，这可能与该菌种长期在此氮源环境中驯化有一定的关系。在试验的几种无机盐中，K2HPO4及CaCl2对发酵产酶也有明显的促进作用。除此外，试验过程中还发现，表面活性剂Tween 80对该菌的发酵产酶也有一定的促进作用。

根据以上单因素试验的结果初步确定了对纳豆芽孢杆菌发酵产酶有促进作用的几个因素:可溶性淀粉、麸皮、黄豆粉、K2HPO4、CaCl2及 Tween 80。

2．1．2 部分析因设计

采用部分析因设计的方法对上述筛选的因素做了进一步的分析，以此来确定对该菌种发酵产酶有显著影响的因素。表1、表2、表3分别给出了部分析因设计的因素水平、试验设计结果及结果的回归分析。

表1 部分析因设计因素水平表

表2 部分析因试验设计及结果

从表3的分析结果可以看出:选取的6个因素均对纳豆芽孢杆菌发酵产酶表现出促进作用;其中可溶性淀粉(A)，黄豆粉(B)，K2HPO4(D)对发酵产酶有极显著的作用(P＜0．01);麸皮(C)对发酵产酶有显著的作用(P＜0．05);曲率分析(表3 Ct Pt项)的结果则表明，部分析因设计确定的试验空间是一个显著的曲面响应(P＜0．01)，其中存在最大或最小响应点。为了确定此试验空间内的极值响应点，后续的试验将以因素A、B及D为对象，在表1所示的各因素水平的取值范围内进行中心组合试验设计及响应曲面分析，同时固定其他因素C、E和F的取值为中水平。

表3 部分析因试验结果的回归分析

2．1．3 中心组合设计

在以上试验结果的基础上进行了中心组合试验设计，考察了可溶性淀粉(A)、黄豆粉(B)和K2HPO4(D)3者的相互作用，试验设计及结果如表4所示。

表4 中心组合试验设计及结果

对表4的试验结果进行回归分析，可以拟合得到以下数学模型:

分析表明，回归模型具有非常高的显著性(P＜0．01)，其 R2为 0．990 1，说明该模型可以解释99．01%的试验结果。图1、图2给出了拟合模型的响应曲面及等高线图，该曲面的形状及相应的等高线图说明在所选取的试验空间中存在最大响应值。利用SAS软件分析确定了该最大响应值为(5 159．2±32．6)U/mL，其对应的因素水平分别为可溶性淀粉3．58%，黄豆粉 2．49%，K2HPO40．234%。由此确定了纳豆芽孢杆菌的发酵产酶培养基为:可溶性淀粉3．58%，黄豆粉 2．49%，麸皮 2%，K2HPO40．234%，CaCl20．2%，Tween 80 0．2%。以优化的发酵培养基按照1．2．2的方法进行发酵试验，4次重复试验结果(5 130、5 156、5 170 和5 185 U/mL)与模型的预测值基本一致，进一步验证了该模型的可靠性。

根据以上优化的试验结果确定了纳豆芽孢杆菌的发酵产酶培养基为:可溶性淀粉3．58%，黄豆粉2．49%，麸皮 2%，K2HPO40．234%，CaCl20．2%，Tween 80 0．2%。

2．2 pH对纳豆芽孢杆菌发酵产酶的影响

考察了培养基起始pH对纳豆芽孢杆菌发酵产酶的影响，结果如图3所示。

图3 培养基起始pH对纳豆芽孢杆菌发酵产酶的影响

pH对该菌种发酵有较显著的影响，起始培养基的酸性或碱性太强均不利于菌体产酶;相比而言，弱碱性的条件更有利于该菌种发酵产酶。根据试验结果确定发酵培养基的起始pH在8．0～8．5的范围较为合适。

2．3 温度对纳豆芽孢杆菌发酵产酶的影响

考察了温度对纳豆芽孢杆菌发酵产酶的影响，结果如图4所示。

图4 温度对纳豆芽孢杆菌发酵产酶的影响

温度对该菌发酵产酶有显著的影响:当温度低于30℃时，发酵产酶受到明显的抑制;温度高于40℃时，酶的产量也受到一定的影响，这可能与酶的失活有关;相比而言，该菌种比较合适的发酵产酶温度在35～38℃范围。

2．4 时间与纳豆芽孢杆菌发酵产酶的关系

探讨了纳豆芽孢杆菌发酵时间与产酶之间的关系，结果如图5所示。

图5 发酵时间与菌体产酶的关系

在发酵的前期(20 h内)，菌体产酶的速度非常缓慢;发酵40 h后菌体进入快速产酶期，而且产酶基本上以恒速进行;发酵60 h后产酶速度逐渐减慢，发酵到72 h后产酶基本上结束，继续发酵将导致酶活的下降。由此确定该菌种合适的发酵时间为70 h左右。

3 结论

在纳豆发酵过程中，大豆蛋白的水解是其中一个重要的生化过程，其与纳豆的营养保健价值及风味形成有着密切的关系，因此对这一过程的探讨对于该产品有着重要的意义。通过对不同来源的纳豆产品进行分离筛选，获得了一株具有高产蛋白酶特性的纳豆芽孢杆菌。采用单因素试验、部分析因试验、中心组合设计及响应面分析对其发酵产酶的培养基及条件进行了优化，确定了较合适的发酵产酶培养基及发酵条件:可溶性淀粉3．58%，黄豆粉2．49%，麸皮 2%，K2HPO40．234%，CaCl20．2%，Tween 80 0．2%，pH 8．0 ～8．5，温度35 ～38 ℃，发酵70 h左右。在优化的基础上，该菌种蛋白酶发酵单位可以达到7 200 U/mL，比优化前提高约2倍。这一结果为后续蛋白酶组分特性及催化性质的分析奠定了工作基础。

［1］段智变，董改香，温晓庆，等．纳豆及其提取物生物活性物质测定［J］．山西农业大学学报，2008，28(2):181－183

［2］王莉，金学年，金成哲，等．纳豆发酵过程中纳豆激酶及活性物质的变化［J］．大连工业大学学报，2006，27(1):5－9

［3］奚晓琦，王加启，卜登攀，等．纳豆芽孢杆菌的分离鉴定及纳豆激酶高产菌株的筛选［J］．东北农业大学学报，2009，40(11):69－75

［4］张丽靖，杨郁．1株纳豆菌抑菌活性及其培养基优化［J］．微生物学杂志，2010，30(1):43－46

［5］张海涛，王加启，卜登攀，等．纳豆枯草芽孢杆菌对犊牛断奶前后瘤胃发酵和酶活的影响［J］．中国畜牧兽医，2009，36(12):5－11

［6］钟青萍，王发祥，钟士清，等．纳豆菌微生态制剂的稳定性研究［J］．食品科学，2006，27(3):133－136

［7］黄占旺，黄庆．纳豆菌的分离与抗菌特性研究［J］．食品科技，2003，(11):7－9

［8］王萍，杜连祥，路福平，等．溶栓纳豆芽抱杆菌的筛选鉴定及产纳豆激酶条件的研究［J］．食品与发酵工业，2006，32(2):74－77

［9］余功保，郭爱玲，秦巧玲，等．一株高产纳豆激酶菌株的筛选及其发酵条件的优化［J］．食品科学，2007，28(4):227－231

［10］陈晓飞，周伏忠，陈国参．纳豆激酶酶学性质研究［J］．河南科学，2010，28(1):41－43

［11］Yamagata Y，Abe R，Fujita Y，et al．Molecular Cloning and Nucleotide Sequence of the 90k Serine Protease Gene，hspK，from Bacillus subtilis(natto)No．16［J］．Current Microbiology 1995，31:340－344

［12］帅明，黄占旺，牛丽亚．纳豆芽孢杆菌产蛋白酶固态发酵条件研究［J］．饲料工业，2008，29(8):18－20

［13］孙妍，王加启，奚晓琦，等．高产蛋白酶纳豆芽孢杆菌的分离筛选与鉴定［J］．沈阳农业大学学报，2010，41(2):175－180

［14］Liu Chuan － bin，Liu Yan，Liao Wei，et al．Application of statistically based experimental designs for the optimization of nisin production from whey ［J］．BioTech－nology Letters，2003，25(11):877－882

［15］Sierecha J K．Purification and partial characterization of a neutral protease from a virulent strain of Bacillus cereus［J］．The International Journal of Biochemistry＆ Cell Biology，1998，30(5):579－595

［16］李永泉，朱志成，李向晨，等．中性蛋白酶发酵工艺优化研究［J］．微生物学通报，1995，22(3):150－154．

Technical Optimization of Protease Production by Bacillus Natto

Pan Jinquan
(School of Life Science and Tech－nology，ZhanJiang Normal University，Zhanjiang 524048)

Bacillus natto was the primary microorganism used in the production of natto，and the study on the process of protease production from Bacillus natto might help to conduct the production of natto．One Bacillus natto of high－yield protease was isolated from natto，and its protease production process was optimized using the response surface methodology．After optimization，the optimum fermentation medium and conditions were obtained:soluble amylum 3．41%，wheat bran 2%，soybeans powder 2．26%，CaCl20．2%，K2HPO40．24%，Tween 80 0．2%，pH 8．0 ～8．5，fermentation temperature 35 ～38 ℃ and time 70 h．Under these optimized conditions，the maximum protease production reached 7 200 U/mL，which increased 2 times than that under the initial conditions．

Bacillus natto，protease，fermentation process，optimization，response surface methodology

Q939．97

A

1003－0174(2011)09－0033－05

时间:2011－07－06 17:00

网络出版地址:http://www．cnki．net/kcms/detail/11．2864．TS．20110726．1700．001．html

CNKI:11 －2864/TS．20110726．1700．001

广东省自然科学基金(9452404801001943)，湛江师范学院基金(ZL0912)

2010－12－19

潘进权，男，1978年出生，讲师，酶与发酵工程