苏云金芽孢杆菌对印度谷螟幼虫的致死作用

刘 芳 曹 阳， 孙长坡 束长龙

苏云金芽孢杆菌对印度谷螟幼虫的致死作用

刘 芳1曹 阳1，2孙长坡2束长龙3

(河南工业大学1，郑州 450052)
(国家粮食局科学研究院2，北京 10037)
(中国农业科学院植物保护研究所3，北京 100094)

根据8株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)的菌悬液对印度谷螟幼虫的生物测定结果，筛选出5株对该幼虫致死作用较好的Bt菌株。提取出5株Bt菌株的杀虫晶体蛋白，再对印度谷螟幼虫进行生物测定，结果表明:0．06 mL/g(饲料)的SC1－B3菌株杀虫晶体蛋白对印度谷螟幼虫的致死率达到100%，同样浓度的Bt33菌株杀虫晶体蛋白对印度谷螟幼虫的致死率超过70%，其余3株Bt的杀虫晶体蛋白致死率较低，致死率小于22．2%，但对印度谷螟幼虫的羽化有明显的抑制作用。

苏云金芽孢杆菌 杀虫晶体蛋白 印度谷螟 幼虫

中国粮食储备量巨大，居世界首位。粮食储藏期较长，储藏期间储粮害虫造成的损失严重。化学防治一直是储粮害虫防治的主要手段，但其在取得快速效果的同时，也引发了粮食污染、环境污染和害虫抗性，以及损害工作人员身体健康等负面问题。发展绿色储粮，保障生态和食品安全，已成为21世纪我国粮食储藏实施可持续发展的重要战略目标［1］。

印度谷螟(Plodia interpunctella)是我国主要储粮害虫之一［2］，幼虫食性复杂、习性隐蔽、善于爬行，成虫飞行、繁殖能力强，对储粮危害巨大，所以寻找高效、无污染的储粮药剂来防治印度谷螟极为必要。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是目前世界上产量最大、应用最成功的微生物杀虫剂。目前已分离的Bt菌株超过了5万株，Bt菌株的杀虫范围已经扩大到包括大量农林及卫生害虫在内的无脊椎的4个门和节肢动物门中9个目的生物［3］。大部分Bt菌株在芽孢形成过程中可以产生由δ－内毒素组成的晶体状内含物，又称为杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins，简称 ICPs)，其含量可以占到芽孢形成过程中菌体产生总蛋白的20%～30%，是苏云金芽孢杆菌中最主要的杀虫活性物质。研究发现Bt可以对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目等多种昆虫，以及线虫、螨类和原生动物等具有特异性的杀虫活性［4］。杀虫晶体蛋白对环境无毒无害，且在动物胃肠道内的酸性环境下才能溶解起到杀虫作用。在人体内没有靶标，对人畜无害，所以是一种安全高效的生物杀虫剂［5］。

国外已有关于Bt菌株及其杀虫晶体蛋白对印度谷螟幼虫影响的研究［6－8］，国内对此方面的研究较少，黄衍章等［9］在试验中发现Bt菌株对印度谷螟幼虫的生长发育有抑制作用，但Bt菌株对印度谷螟的致死作用没有很好的效果。本试验采用8种Bt菌株对印度谷螟幼虫进行生物测定试验，筛选出5株高效的Bt菌株。通过扩大培养，提取杀虫晶体蛋白，用Bt杀虫晶体蛋白对印度谷螟幼虫进行生物测定，以期为我国今后防治印度谷螟提供参考方法。

1 材料与方法

1．1 材料与仪器

1．1．1 材料

印度谷螟1龄、3龄幼虫由国家粮食局科学研究院实验室人工饲养。印度谷螟饲料配比见表1。

表1 人工印度谷螟饲料配比

Bt菌株 MO3 － A5、MO3 － G4、B7、Bt33、Bt35、SC1－B3、SC1－A11、B4，8株菌株由中国农业科学院植物保护研究所提供。

1．1．2 试验仪器和设备

DGG－9140BD电热恒温鼓风干燥箱:上海森信实验仪器有限公司生产;恒温恒湿培养室:国家粮食局科学研究院;ST70双目体式显微镜:舜宇仪器有限公司;AKATA Explorer葡聚糖凝胶G50脱盐柱以及蛋白分析系统:瑞典Pharmacia公司，Mini－protean 4蛋白电泳系统:美国bio－rad伯乐公司。

1．2 方法

1．2．1 Bt菌悬液制备

活化待测8株苏云金芽孢杆菌，以1% 接种量转接于牛肉膏蛋白胨培养基中(3%牛肉膏，5%蛋白胨，pH 7．0，121 ℃灭菌 20 min)，30 ℃，230 r/min 培养至芽孢晶体分离，离心收集菌体，用培养基1/10体积无菌水悬浮孢晶混合物，4℃保存待测。

1．2．2 印度谷螟的饲养方法

将羽化1～2 d的印度谷螟成虫，接入到产卵器中。2 d后将虫卵取出，在体式镜下检查虫卵的质量，挑取完好的虫卵备用。

按表1配制饲料，然后将虫卵接入饲料中。放入光照培养室中培养(28℃，75%RH)，每天观察生长情况。羽化1～2 d后，重复以上过程扩大培养。

1．2．3 Bt菌悬液对印度谷螟幼虫的毒力测定

将8株Bt菌悬液与配制好的印度谷螟饲料以0．167 mL/g浓度的混合，空白对照组饲料与无菌水以同样比例混合，取3 g放入小玻璃瓶中，每瓶接入5头印度谷螟3龄幼虫，6组重复。放到温度30℃，相对湿度75%，光照12 h/d的条件下恒温恒湿培养室饲养，20 d后记录试虫的羽化及死亡情况。

1．2．4 杀虫晶体蛋白的提取

在30℃条件下活化所要的5株Bt菌株12 h。然后将5株菌株分别转入牛肉膏蛋白胨培养基中进行培养(30℃，120 r/min，摇36 h)。镜检，菌体裂解，晶体释放，菌液离心(8 000 r/s，10 min)，弃上清液。将沉淀物用蒸馏水悬起，离心，弃上清。沉淀物用1 mol/L NaCl悬起，超声波破碎5 min，离心(8 000 r/s，10 min)，弃上清液。沉淀物用10 mL蒸馏水悬起，加入等体积的蛋白裂解液(100 mmol/L Na2CO3/NaHCO3，20 mmol/L DTT，pH 10．5)室温孵育 1 h，离心取上清。上清液利用葡聚糖凝胶G50脱盐柱(GE)除去DTT与小分子物质后置于－20℃冰箱待测。得到所需要的目的蛋白，SDS－PAGE电泳，SDS－PAGE电泳参照 bio－rad，Mini－protean 4说明进行。

1．2．5 Bt杀虫晶体蛋白对印度谷螟的毒力测定

将5株Bt杀虫晶体蛋白与配制好的印度谷螟饲料以0．06 mL/g比例混合，空白对照组饲料与无菌水以同样浓度混合，分别取9 g放入小玻璃瓶中，接入15头印度谷螟1龄幼虫，3组重复。放到温度30℃，相对湿度75%，光照12 h/d的恒温恒湿培养室饲养，每天记录试虫的羽化及死亡情况。

1．2．6 数据处理方法

校正死亡率计算公式:

校正死亡率=(实验组死亡率－对照组死亡率)/(1－对照组死亡率)×100%

平均校正死亡率的标准误差及显著性分析采用DPSv7．05专业版软件处理。

2 结果与分析

2．1 Bt菌株对印度谷螟幼虫的致死结果

8种Bt菌悬液对印度谷螟3龄幼虫进行生物测定，结果见表2。

表2 8株Bt菌株对印度谷螟3龄幼虫处理20 d的致死率(0．167 mL/g)

由表2看出，8株菌株的悬菌液对印度谷螟幼虫都有一定的致死效果，SC1－B3菌株对印度谷螟幼虫校正致死率达到93．3%，与对照及其他几组有显著差异。Bt33、MO3 －A5、SC1 －A11、B7，4 株 Bt菌株对印度谷螟幼虫的致死率都在30%～50%之间，4株菌株间差异不显著，与对照组差异显著。以上结果表明4株Bt菌株对印度谷螟幼虫有一定的致死效果，但效果不显著。其中MO3－G4、Bt35、B4，3株Bt菌株对印度谷螟幼虫的致死率小于20%，与对照差异不显著，说明这3株Bt菌株对印度谷螟幼虫毒力效果不明显。因此后续杀虫蛋白提取研究选用 SC1－B3、Bt33、MO3－A5、SC1－A11、B7，5株菌株。

2．2 杀虫晶体的分析

提取Bt菌株产生的杀虫晶体蛋白，并进行SDSPAGE电泳检测，结果见图1。

图1 5株Bt蛋白的SDS－PAGE电泳图

从图1可以看出5株Bt杀虫晶体蛋白(SC1－B3、Bt33、MO3－A5、SC1 －A11、B7)都有明显条带出现，证明Bt杀虫晶体蛋白制备成功。

2．3 Bt杀虫晶体蛋白对印度谷螟幼虫的生物测定结果

2．3．1 Bt杀虫晶体蛋白对印度谷螟幼虫化蛹的影响

使用5株杀虫晶体蛋白对印度谷螟1龄幼虫进行了生物测定试验，并将9组45头试虫的羽化时间与羽化率用Excel折线图进行分析(图2)，试验结果发现，试验组的羽化时间比对照组的羽化时间延长很多。

图2 不同Bt杀虫晶体蛋白对印度谷螟羽化时间影响

从图2中看出对照组从22 d开始羽化，到26 d时羽化率开始保持不变，证明除了个别自然死亡的试虫外，其余全部羽化。而试验组在第26 d的时候羽化率为0% ～20%，到33 d后羽化率保持不变。除了SC1－B3这株菌株致死率达到100%，其余4株Bt杀虫晶体蛋白都出现羽化时间延长情况，说明印度谷螟幼虫在取食杀虫晶体蛋白后，Bt杀虫晶体蛋白对印度谷螟幼虫有一定的毒力作用，并可以起到抑制其化蛹，延长其羽化时间的作用。

2．3．2 杀虫晶体蛋白对印度谷螟幼虫毒力效果分析

5株杀虫晶体蛋白对印度谷螟1龄幼虫进行毒力测定试验，试验结果保持不变后，统计死亡率，结果见表3。

表3 Bt蛋白对印度谷螟1龄幼虫处理35 d的致死率(0．06 mL/g)

从表3中可见，5组试验的死亡数都比对照组的高，证明5株杀虫晶体蛋白都在一定程度上对印度谷螟有致死作用，其中SC1－B3和Bt33这两株Bt杀虫晶体蛋白的致死率分别达到100%和73．3%，与对照组差异显著，毒力效果很好。其余3株Bt杀虫晶体蛋白的致死率均未超过30%，与对照组差异不显著，毒力效果不明显。

3 讨论与结论

迄今为止，我国对Bt杀虫晶体蛋白的研究只停留在对农业害虫的研究和应用上，韩岚岚等［10］将几种Bt杀虫晶体蛋白在对小菜蛾幼虫的活性测定中，得到很好的毒力效果。另外在大田应用上也取得了很好的经济和生态效益。而在储粮害虫防治上研究和应用均很缓慢。虽然利用苏云金芽孢杆菌防治印度谷螟已有报道，但多停留在试验阶段，将Bt杀虫晶体蛋白应用到储粮害虫的研究还未见报道，离市场化仍具有较大的差距［11］。

本试验通过对Bt菌株及Bt杀虫晶体蛋白对印度谷螟幼虫的生物测定，筛选出2株毒力效果很好的杀虫晶体蛋白，而且发现杀虫晶体蛋白对印度谷螟的化蛹起到一定的抑制作用，下一步将这几株Bt菌株进行扩大培养，制成Bt杀虫晶体蛋白干粉，进一步进行实仓试验，再逐步推向市场化，这将大大提高我国储粮上防治印度谷螟的效果，推动我国储粮害虫绿色防治技术的发展。

［1］王平坪，李燕羽，张军党，等．惰性粉杀虫剂在绿色储粮中的应用［J］．粮油储藏，2008，33(2):33 －35

［2］孟永青．蛾类储粮害虫的主要种类及防治方法［J］．西部粮油科技，2002，27(1):49 －50

［3］王广君．高效广谱苏云金芽孢杆菌工程菌的构建及杀虫晶体蛋白的研究［D］．北京:中国农业科学院，2005

［4］郑大胜，闫建平，罗绍彬，等．新型杀虫蛋白VIPs研究进展［J］．微生物学杂志，2001，22(3):35 －37

［5］曹正明．苏云金芽孢杆菌与现代生物农药［J］．现代农业科技，2008，2(20):140 －142

［6］Johnson D E，Oppert B，McGaughey W H．Spore Coat Protein Synergizes Bacillus thuringiensis Crystal Toxicity for the Indianmeal Moth(Plodia interpunctella)［J］．Current Microbiology，1998，36(5):278 －282

［7］Johnson D E，McGaughey WH．Contribution of Bacillus thuringiensisspores to toxicity of purified cry proteins Indian meal moth larva［J］．Current Microbiology，1996，33(1):54 －59

［8］Corina M B，Graciela L S．Characterization of Bacillus thuringiensis isolates from Argentina that are potentially useful in insect pest control［J］．BioControl，2006，51(6):779 －794

［9］黄衍章，李世广，王转红．苏云金芽孢杆菌对印度谷螟幼虫生长发育的影响［J］．华中农业大学学报，2010，29(2):148－151

［10］韩岚岚，戴长春，宋福平，等．几种苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白对黑龙江省主要蔬菜害虫小菜蛾活性分析［J］．植物保护，2008(8):198 －200

［11］吴继星，陈在佴，李青，等．苏云金杆菌研究进展［J］．湖北农业科学，1995，1(6):43 －45．

Lethality of Bacillus Thuringiensis to Larvae of Plodia Interpunctella

Liu Fang1Cao Yang1，2Sun Changpo2Shu Changlong3
(Henan University of Tech－nology1，Zhengzhou 450052)
(Academy of State Administration of Grain2，Beijing 100037)
(Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences3，Beijing 100094)

The bacterial suspensions of eight strains of Bacillus thuringiensis(Bt)against the Plodia interpunctella larva have been carried out in this paper．The five strains of high effective Bt were selected among 8 strains．After the insecticidal crystal protein(ICP)of the 5 strains has been extracted，the toxicity of ICP to the larva of P．interpunctella have been assayed．The results indicated that the lethality of the larva was 100%by using ICPof SC1 －B3 strains at 0．06 mL/g concentration．It was more than 70%lethality by using ICPof Bt33 strains，and it was less than 22．2%lethality by using ICP of other 3 strains，at same concentration．

Bacillus thuringiensis，insecticidal crystal proteins，Plodia interpunctella

Q965．9

A

1003－0174(2011)09－0079－04

国家科技支撑计划(2009BADAOB005－3)

2010－11－16

刘芳，女，1986年出生，硕士，农业昆虫与害虫防治

曹阳，男，1958年出生，研究员，粮油仓储科技