辣椒小孢子母细胞减数分裂过程中微管的分布变化

刘胜姿，王留英，邱义兰*，刘如石，王晓辉，刘少军

(1.湖南师范大学医学院，中国 长沙 410081; 2.湖南师范大学生命科学学院，中国 长沙 410081)

微管作为细胞骨架主要成分之一，广泛存在于真核生物细胞中．在植物细胞中，微管通过分布状态的变化与微丝共同参与众多的生命活动，如细胞形态建成、染色体迁移、细胞分裂与分化、细胞壁构建和信号传导等[1-4]．到目前为止，有关高等植物有性生殖过程中细胞骨架的研究主要集中于花粉的萌发和生长与细胞骨架变化动态的关系[5-11]．有关高等植物雄性细胞发育早期减数分裂过程中细胞骨架的研究则不多[12-16]．高等植物不同种植物的减数分裂特征不同，其微管骨架的分布变化也存在差异．本实验对辣椒 (CapsicumannumL.) 减数分裂过程中的微管变化进行了观察，探索其微管骨架分布特征，为丰富高等植物减数分裂过程中细胞骨架的作用奠定基础．

1 材料与方法

供试材料为辣椒(CapsicumannumL.) 牛角椒2号品种．4月中旬种植于湖南师范大学生命科学学院植物生理网室．取花芽分化后减数分裂各个时期的花药，依次进行以下处理．

固定：用含有40 g/L多聚甲醛、100 g/L蔗糖、50 mmol·L-1PIPES缓冲液 (pH 6.9)、100 g/L二甲基亚砜和10 g/LTriton X-100的固定液在室温条件下固定1 h，然后用50 mmol·L-1PIPES缓冲液 (pH 6.9) 冲洗3次, 每次5 min．取出花药, 在涂有多聚赖氨酸溶液的载玻片上, 轻压花药使药室内的花粉细胞逸出．

酶解：将10 g/L的蜗牛酶(50 mmol·L-1PIPES缓冲液配制, pH 6.9)覆盖于细胞之上, 室温保湿酶解10～15 min．酶解后, 用50 mmol·L-1PIPES缓冲液(pH 6.9)冲洗3次，每次5 min．

免疫反应预处理: 用10 g/L的牛血清蛋白溶液(50 mmol·L-1PIPES缓冲液配制, pH 6.9)封闭细胞1 h, 并用含NaCl 138 mmol·L-1、KCl 2.68 mmol·L-1、KH2PO41.47 mmol·L-1、Na2HPO48.1 mmol·L-1磷酸缓冲液 (PBS) 洗3次，每次5 min．

微管免疫反应: 经上述处理过的细胞, 先与一抗——鼠抗微管蛋白(Sigma, PBS缓冲液稀释, 稀释度为1∶350)在一定湿度下37 ℃温育1 h，PBS缓冲液冲洗3次, 每次10 min．再用二抗——FITC(fluorescein isothiocyanate, 异硫氰酸荧光素)标记的羊抗小鼠IgG (Sigma, PBS缓冲液稀释, 稀释度为1∶200) 在一定湿度下37 ℃温育1 h, PBS缓冲液冲洗3次, 每次10 min．

染色体及细胞核的标记：先配置DAPI(4′,6-diamidine-2′-phenylindole, 4′,6二脒基-2-苯吲哚)母液(1 g/L), 用时用PBS缓冲液1∶300稀释水溶液对细胞染色5 min, 随即用PBS缓冲液冲洗．

封片及观察：体积分数为20%的甘油封片后用Leica共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP5)及图像处理系统进行观察，FITC激发波长为488 nm, DAPI激发波长为364 nm．

2 实验结果

在小孢子母细胞时期，小孢子母细胞最显著的特征是外面被一层厚厚的胼胝质壁包围(图1a)．小孢子母细胞进入减数分裂前的间期，细胞质中大部分微管蛋白呈弥散分布，只有少量的微管积聚，形成细胞周质微管，细胞核位于细胞中央(图1b)．当小孢子母细胞由间期向分裂期过渡的时候，微管蛋白积聚成丝，呈笼形分布于细胞质中，细胞核被包裹在笼形结构之中(图1c)．随着进一步发育，小孢子母细胞进入减数分裂Ⅰ中期，细胞中几乎所有的微管聚合成纺锤体，染色体排列在纺锤体的赤道板，把纺锤体分隔为2个半纺锤体(图1d)．当小孢子母细胞进入减数分裂I 后期，着丝粒微管向两极拉伸缩短，将染色体拉向两极后，它形成扁平的帽状结构，在2组染色体之间存在极丝微管(图1e)，随后在连接2组染色体的极丝微管增多，荧光强(图1f)．至末期Ⅰ，2细胞核之间的微管荧光明显减弱，由细胞核表明向四周辐射出一些微管(图1g)．继续向前发育，细胞质中丝状的微管消失，呈现均匀的弱荧光，而在2个子核的周围聚集了较多的微管，荧光很强(图1h)．辣椒小孢子母细胞的减数分裂属同时型，减数分裂I结束后，在2个子核之间并没有形成细胞壁，也没有形成二分体．当减数分裂II开始后，在小孢子母细胞中又开始形成2个纺锤体，2个子核的纺锤体平行或者呈一定的角度交叉排列，纺锤体的中间为染色体(图1i)．进入减数分裂Ⅱ后期，着丝粒微管将染色体拉向两极，形成2套姊妹染色体组，在姊妹染色体组之间存在极丝微管，而非姊妹染色体组之间没有微管(图1j)，随后，极丝微管逐渐消失，微管集中在4套染色体组表面向四周呈辐射状分布(图1k)．随着发育的继续进行，非姊妹染色体组之间也形成微管，支持4个细胞核呈特定空间分布(图1l)．进入减数分裂Ⅱ末期，形成4个子核，每2个子核之间均有平行的微管丝相连(图1m)．胞质分裂是从细胞核之间的质膜向内缢缩开始(图1n)．随着发育，缢缩继续进行，连接细胞核之间的微管逐渐减少(图1o)．最后，4个细胞核被新形成的细胞壁完全隔离，构成四分体，在四分体小孢子中的微管由细胞核表面向细胞四周呈辐射状分布(图1p)．

所有图片标尺=5 μm a:辣椒小孢子母细胞被一层厚厚的胼胝质壁包裹；b:小孢子母细胞中的微管骨架的分布；c:小孢子母细胞中的微管呈笼形；d:小孢子母细胞减数分裂I中期形成纺锤体微管；e:小孢子母细胞减数分裂I后期，着丝粒微管缩短并集中在两极呈帽形, 两极之间存在一些极丝微管；f:细胞两极之间的极丝微管进一步增加；g:小孢子母细胞减数分裂I末期，微管由两个核表面往四周辐射分布；h:微管主要集中在两个核表面；i:小孢子母细胞减数分裂II中期，微管形成两个纺锤体；j:小孢子母细胞减数分裂II后期，两个纺锤体微管缩短，将染色体拉向两极，姊妹染色体组之间有一些极丝微管，非姊妹染色体组之间没有微管；k:微管集中在4套染色体组表面向四周辐射分布；l:非姊妹染色体组之间也形成微管，支持4个特定空间分布的细胞核；m:小孢子母细胞减数分裂II末期，形成4个细胞核，核之间均形成平行的微管束；n:细胞核之间的质膜开始向心缢缩，细胞核之间的微管束减少；o:细胞质进一步缢缩，细胞核之间的微管束也进一步减少；p:胞质分裂完成后形成的四分体，在四分体小孢子中的微管由细胞核表面向细胞四周呈辐射状分布．图1 辣椒小孢子母细胞减数分裂过程

3 讨论

在细胞分裂过程中，处于解聚和聚合动态变化中的微管骨架与染色体运动、胞质分裂和细胞壁形成密切相关．根据花粉母细胞减数分裂中胞质分裂的次数，高等植物的减数分裂可分为同时型和连续型2种类型．多数单子叶植物的花粉母细胞减数分裂为连续型，第一次分裂即产生新壁，形成二分体．有关玉米[17]、水稻[12]等单子叶植物减数分裂过程中微管骨架的研究表明，减数分裂细胞中主要存在3种微管类型：即减数分裂前期的核周胞质微管，中期的纺锤体微管和后期的成膜体微管．不同的微管构型在细胞中的功能不同：前期呈网络状的核周胞质微管参与了细胞核的定位及向细胞表面的物质运输作用；中期的纺锤体微管主要是细胞分裂时将染色体拉向两极；成膜体微管在胞质分裂时定位细胞板的位置．Shamina等[15]进一步研究了单子叶植物减数分裂I末期成膜体的形成过程，发现在减数分裂I末期，组成纺锤体的中部微管和一些新形成的微管向赤道板集中形成了成膜体，构成了连续型四分体的胞质分裂基础，产生了二分体．然而，多数双子叶植物为同时型，第一次分裂不产生新壁，无二分体阶段，直到第二次分裂末期，形成4个子核后才同时产生细胞壁．Traas等[18]在有关胞质分裂同时型植物的研究中观察到，在中期Ⅰ之后没有形成成膜体，因此末期Ⅰ未形成二分体，而在末期Ⅱ后同时形成了四分孢子．在本实验中，作者观察到辣椒小孢子母细胞减数分裂过程中出现了前期的核周胞质微管和中期的纺锤体微管．辣椒小孢子母细胞减数分裂为同时型，在其减数分裂I后期纺锤体微管没有形成成膜体，不发生胞质分裂，没有二分体的形成．减数分裂II后期纺锤体微管也没有形成成膜体，到减数分裂快要结束时才通过细胞缢缩方式进行胞质分裂．由此可看出，一方面，高等植物小孢子母细胞减数分裂中同时型和连续性差异的关键是成膜体的形成与否．另一方面，动物细胞的胞质分裂是通过细胞缢缩方式进行的，该过程只有在微管和微丝骨架的协调作用下才能正常完成，其中微管骨架可能参与分裂沟的定位和分裂沟内缩的起始, 而微丝骨架则主要负责分裂沟的内缩[19]．高等植物同时型小孢子母细胞减数分裂中的胞质分裂是否像动物细胞分裂中由微丝与微管共同调控，还有待进一步的研究．

参考文献：

[1] DERKSEN J, WILMS F H A, PIERSON E S. The plant cytoskeleton: its significance in plant development [J]. Acta Bot Neerl, 1990, 39:1-18.

[2] CYR R J. Microtubules in plant morphogenesis: role of the cortical array [J]. Annu Rev Cell Biol, 1994, 10：153-180.

[3] TIAN G W, SMITH D, GLÜCK S, BASKIN T I. Higher plant cortical microtubule array analyzed in vitro in the presence of the cell wall [J]. Cell Motil Cytoskel, 2004, 57(1)：26-36.

[4] 朱 澂. 植物体细胞微管周期及微丝周期 [M]// 徐是雄, 朱 澂.植物细胞骨架. 北京：科学出版社，1996.

[5] HESLOP-HARRISION J, HESLOP-HARRISON Y. Myosin associated with the surfaces of organelles, vegetative nuclei and generative cells in angiosperm pollen grains and tubes[J]. J Cell Sci, 1989, 94: 319-325.

[6] LANCELLE S A, HEPLER P K. Association of actin with cortical microtubules revealed by immunogold localization inNicotianapollen tubes [J]. Protoplasma, 1991, 165(1-3): 167-172.

[7] PIERSON E S, CRESTI M. Cytoskeleton and cytoplasmic organization of pollen and pollen tubes [J]. Int Rev Cytol, 1992, 140: 73-125.

[8] TANAKA I, WAKABAYASHI T. Organization of actin and microtubule cytoskeleton proceeding pollen germination [J]. Planta, 1992, 186: 473-482.

[9] TERASAKA O, NIITSU T. Differential roles of microtubule and actin-myosin cytoskeletion in the growth of Pinum pollen tubes [J]. Sex Plant Reprod, 1994(7): 264-272.

[10] CAI G, MOSCATELLI A, CRESTI M. Cytoskeleton organization and pollen tube growth [J]. Trends Plants Sci, 1997, 2(3): 86-91.

[11] TIWARI S C, POLITO V S. Organization of the cytoskeleton in pollen tubes of Pyruscommunis: a study employing conventional and freeze-substitution electron microscopy, immunofluorescence, and rhodamine-phalloidin [J]. Protoplasma, 1998, 147(2-3): 100-112.

[12] 冯九焕, 刘向东, 卢永根. 水稻小孢子发生过程中微管骨架的初步研究 [J]. 华南农业大学学报, 1999, 20(3): 1-5.

[13] 杨 军, 余春红, 王新宇, 等.洋葱花粉母细胞细胞内、细胞间微梁骨架的超微结构观察 [J]. 植物学报, 2001, 43(4):331-338.

[14] SHAMINA N V. Formation of division spindles in higher plant meiosis [J]. Cell Bio Int, 2005, 29(4): 307-318.

[15] SHAMINA N V, GORDEEVA E I, KOVALEVA N M,etal. Formation and function of phragmoplast during successive cytokinesis stages in higher plant meiosis [J]. Cell Bio Int, 2007, 31: 626-635.

[16] 张正海, 康向阳, 刘明虎, 等. 小胡杨小孢子发生及微管骨架变化 [J]. 北京林业大学学报, 2008, 30(6): 36-40.

[17] STAIGER C J, CANDE W Z. Microtubule distribution indv, a maize meiotic mutant defective in the prophase to metaphase transition [J]. Devel Biol, 1990, 138(1):231-242.

[18] TRAAS J A, BURGAIN S, DUMAS R. The organization of the cytoskeleton during meiosis in eggpiant (SolanummelongenaL.): microtubules and F-action are both necessary for coordinated meiotic division [J]. J Cell Sci, 1989, 92:541-550.

[19] 陈忠才, 蔡 尚, 蒋 青, 等. 微管和微丝骨架综合调控动物细胞胞质分裂过程 [J]. 科学通报, 2005, 50(3): 225-231.