胰腺癌组织K-ras基因第12密码子突变的定量检测

顾俊骏 高军 龚燕芳 黄浩杰 王小玮 路华 李兆申

·论著·

胰腺癌组织K-ras基因第12密码子突变的定量检测

顾俊骏 高军 龚燕芳 黄浩杰 王小玮 路华 李兆申

目的检测胰腺癌及相应癌旁组织K-ras基因第12密码子的突变量，分析其与胰腺癌临床病理参数的关系。方法应用肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)钳制双荧光标记探针的实时定量PCR法检测93例胰腺癌组织及其癌旁组织中K-ras基因第12密码子的突变拷贝数，以突变百分率表示突变量。K-ras基因突变百分率=K-ras突变型拷贝数/(K-ras野生型拷贝数+K-ras突变型拷贝数)×100%。结果胰腺癌及其癌旁组织的K-ras基因第12密码子突变率分别为83.9%和65.6%，相差显著(P<0.05)；它们的突变量分别为(13.385±1.745)%和(2.246±0.728)%，相差亦显著(P<0.05)。K-ras基因第12密码子突变量与临床病理参数无关。结论胰腺癌及相应癌旁组织不仅存在K-ras基因突变率的差异，亦存在K-ras基因突变量的差异。

胰腺肿瘤； K-ras基因； 实时定量PCR； 突变

K-ras基因突变率在胰腺导管增生中为26%，乳头状增生中为46%，原位癌中为76%，导管癌中为82%[1]，且98%的突变发生在第12密码子[2-3]。晚近文献[4]报道，K-ras突变量也存在差异，定量检测K-ras基因突变可为胰腺癌的诊断提供更好的参考价值。为此，本实验室采用双荧光标记探针实时定量PCR法检测胰腺癌及其癌旁组织的K-ras基因第12密码子的突变量，分析其与临床病理参数的关系，探讨其临床应用价值。

材料和方法

一、临床资料

收集2006年4月至2009年9月我院手术治疗的经病理证实的胰腺癌患者93例。其中男性54例，女性39例，年龄35～77岁，中位年龄59岁。所有患者术前均未进行化疗和放疗。

二、方法

1．肽核酸(peptide nucleic acid，PNA)钳制实时荧光定量PCR法：应用酚-氯仿法抽提胰腺癌及相应癌旁组织的DNA。针对野生型K-ras基因第12、13密码子自行设计PNA，由韩国panagene公司合成。K-ras-FAM Tagman MGB野生型GGT序列，突变型GAT、GTT、GCT、AGT、TGT、CGT序列参阅发明专利(专利申请号：201010512125.4)。引物自行设计后均由美国Applied Biosystems公司合成。K-ras上游引物5′-AGGCCTGCTGAAAATGACTGAAT-3′，下游引物5′-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3′。TaqMan Gene Expression Master Mix购买于美国Applied Biosystems公司。K-ras基因野生型标准品GGT和K-ras基因突变型标准品GAT、GCT、GTT、AGT、CGT、TGT由上海Invitrogen公司合成。操作仪器选用ABI公司的7500型实时定量PCR仪。反应体系包括：TaqMan Gene Expression Master Mix 12.5 μl，上、下游引物各 0.5 μl(5 pmol/μl)，PNA 1 μl(10 pmol/μl)，MGB探针各0.3 μl(10 pmol/μl)，DNA标准品模板为106、105、104、103、102、10、0拷贝，用无菌双蒸水定容至25 μl。PCR反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、76℃ 15 s，60℃ 60 s， 50个循环。

2．K-ras基因第12密码子突变类型和定量分析： K-ras第12密码子第一碱基 GAT、GTT、GCT三种突变类型由FAM荧光标记； K-ras第12密码子第二碱基AGT、TGT、CGT三种突变类型由VIC荧光标记。根据荧光类型判定K-ras第12密码子突变类型。采用标准品绝对定量PCR的方法得到每个样本的K-ras野生型和K-ras突变型的拷贝数。由于试剂批次、仪器设备、实验操作等因素对检测的突变拷贝数影响较大，而突变百分率能够更准确和稳定地反映突变量[5]，故本文采用突变百分率表示。K-ras基因突变百分率=K-ras突变型拷贝数/(K-ras野生型拷贝数+K-ras突变型拷贝数)×100%。

三、统计学处理

结 果

一、K-ras基因第12密码子的突变率

实时定量PCR扩增曲线和标准曲线见图1。78例胰腺癌K-ras基因第12密码子发生突变，突变率为83.9%(78/93)，其中第一碱基突变64例，第二碱基突变14例。61例癌旁组织K-ras基因第12密码子发生突变，突变率为65.6%(61/93)，其中第一碱基突变51例，第二碱基突变10例。胰腺癌与癌旁组织的K-ras基因第12密码子突变率相差显著(P<0.05)。

二、K-ras基因第12密码子的突变百分率及其比值

胰腺癌及其癌旁组织的K-ras基因第12密码子突变百分率分别为(13.385±1.745)%和(2.246±0.728)%，两者差异显著(P<0.05，图2)。

图1野生型K-ras基因和突变型K-ras基因的扩增曲线(a、c)和标准曲线(b、d)

图2胰腺癌及其癌旁组织中K-ras基因第12密码子的突变百分率

93例配对的胰腺癌及其癌旁组织中K-ras基因

第12密码子突变百分率的比值为44.4±9.6。其中82例胰腺癌组织K-ras基因的突变百分率高于相应的癌旁组织，它们的比值为57.8±12.0；11例癌组织的突变百分率低于相对的癌旁组织，其比值为-3.2±1.0。

三、K-ras基因第12密码子突变百分率与临床病理参数的关系

K-ras基因的突变与年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移和临床分期等临床病理参数均无关(表1)。

表1胰腺癌及其癌旁组织K-ras基因突变百分率与肿瘤临床病理参数的相关性

临床参数 癌组织r值(P值)癌旁组织r值(P值)年龄 -0.048(0.662)0.137(0.210)性别 -0.024(0.828)0.063(0.559)肿瘤大小 0.022(0.843)0.130(0.242)淋巴结转移-0.155(0.157)0.137(0.211)远处转移 -0.128(0.243)-0.130(0.236)临床分期 -0.153(0.168)0.091(0.415)

讨 论

K-ras基因突变通常被认为是胰腺癌发生的早期事件，并且K-ras基因的突变率从正常胰腺导管细胞、慢性胰腺炎的扁平或者乳头状异型增生到胰腺癌逐步升高[5]。即使存在K-ras基因突变，其突变量的高低也不同。

定量检测K-ras基因突变不仅可以测定突变拷贝量，同时能够对K-ras基因突变类型进行分析，而无需进一步测序，具有省时、方便的特点。本实验在106拷贝数的野生型K-ras基因中可检出的突变型K-ras基因的最低拷贝数为10，突变型与野生型的比例达1∶105，即检测灵敏度为0.001%，其特异性几乎达100%，显著高于目前常用的高分辨率溶点曲线分析1%～0.1%的灵敏度[6]。

Tada等[4]采用K-ras基因定量法检测不同胰腺疾病的标本,结果提示胰腺癌的K-ras基因突变量高于良性胰腺病变，而且良性胰腺病变即使存在K-ras基因突变, 其突变量也较低。Shi等[7]定量检测胰腺癌和慢性胰腺炎患者胰液中的K-ras突变百分率，结果显示胰腺癌患者胰液中K-ras的突变百分率为0.05%～82%，明显高于慢性胰腺炎患者的0～0.7%,并且胰腺癌胰液的K-ras突变类型与原发肿瘤相一致。本结果也显示，胰腺癌组织K-ras突变百分率显著高于相应癌旁组织。但本组有11例胰腺癌K-ras基因突变百分率低于癌旁组织，其原因可能是未运用显微切割造成取材的误差，也可能是由于肿瘤的异质性所致[6]。

本方法不仅可以检测手术、穿刺活检等K-ras基因突变百分率较高的组织标本，更适合用于诸如血浆、血清、胰液、胸腹水等K-ras基因突变百分率较低的样本。目前，我们正在对胰腺疾病患者血液中K-ras基因突变量进行检测，初步显示K-ras基因突变量的检测对肿瘤的诊断、疗效的评价以及生存期的预测都可能有一定的临床应用价值。

[1] Cerny WL,Mangold KA,Scarpelli DG.K-ras mutation is an early event in pancreatic duct carcinogenesis in the Syrian golden hamster.Cancer Res,1992,52:4507-4513.

[2] Queneau PE,Adessi GL,Thibault P,et al.Early detection of pancreatic cancer in patients with chronic pancreatitis: diagnostic utility of a K-ras point mutation in the pancreatic juice.Am J Gastroenterol,2001,96:700-704.

[3] Forrester K,Almoguera C,Han K,et al.Detection of high incidence of K-ras oncogenes during human colon tumorigenesis.Nature,1987,327:298-303.

[4] Tada M,Komatsu Y,Kawabe T,et al.Quantitative analysis of K-ras gene mutation in pancreatic tissue obtained by endoscopic ultrasonography-guided fine needle aspiration:clinical utility for diagnosis of pancreatic tumor.Am J Gastroenterol,2002,97:2263-2270.

[5] Bai RK,Wong LJ.Detection and quantification of hepatoplasmic mutant mitochondrial DNA by real-time amplification refractory mutation system quantitative PCR analysis:a single-step approach.Clin Chem,2004,50:996-1001.

[6] Kramer D,Thunnissen FB,Gallegos-Ruiz MI,et al.A fast sensitive and accurate high resolution melting (HRM) technology-based assay to screen for common K-ras mutations.Cell Oncol,2009,31:161-167.

[7] Shi C,Fukushima N,Abe T,et al.Sensitive and quantitative detection of KRAS2 gene mutations in pancreatic duct juice differentiates patients with pancreatic cancer from chronic pancreatitis,potential for early detection.Cancer Biol Ther,2008,7:353-360.

2010-10-20)

(本文编辑：屠振兴)

QuantitativedetectionofmutationofK-rasgeneatcodon12

GUJun-jun,GAOJun,GONGYan-fang,HUANGHao-jie,WANGXiao-wei,LUHua,LIZhao-shen.

DepartmentofGastroenterology,ChanghaiHospital,SecondMilitaryUniversity,Shanghai200433,China

LIZhao-shen,Email:zhsli@81890.net

ObjectiveTo quantitatively analyze the K-ras gene mutation at codon 12 in pancreatic cancer tissues and the relationship between K-ras gene mutation and clinicopathological parameters.MethodsQuantitative detection of K-ras gene at codon 12 in 93 pairs of pancreatic cancer and adjacent tissues were performed by using PNA-mediated PCR clamping with two different fluorescence labeled probes. The quantity of mutation was expressed by percentage of mutation. The percentage of K-ras gene mutation=the copy of K-ras mutation/(copy of wild type K-ras+copy of K-ras mutation)×100%.ResultsThe percentage of mutation of K-ras gene at codon 12 in pancreatic cancer and adjacent tissues were 83.9% and 65.6%, and the difference was statistically significant(P<0.05); and the quantity of mutation were (13.385±1.745)% and (2.246±0.728)%, and the difference was also statistically significant(P<0.05). The quantity of mutation of K-ras gene at codon 12 was not associated with clinicopathological parameters.ConclusionsThe percentage of K-ras gene mutation, as well as the quantity of K-ras gene mutation was different in pancreatic carcinoma and adjacent tissues.

Pancreatic neoplasms; K-ras gene; Rreal-time PCR; Mutation

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2011.01.011

国家科技支撑计划资助(2006BAI2A12)

200433 上海，第二军医大学长海医院消化内科

李兆申，Email：zhsli@81890.net