鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的组成及其性质

王 耀 耀， 朱 蓓 薇， 董 秀 萍， 叶 文 秀， 肖 桂 华

（大连工业大学 食品学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

鲍鱼属软体动物门、腹足纲、鲍科，其营养丰富、味道鲜美，具有很高的食用价值。鲍鱼的可食用部分主要是腹足，腹足中与壳肌相连的中间部位肌原纤维含量较高，而腹足边缘部位胶原蛋白的含量相对较高［1］。关于蛋白质的研究表明，肌原纤维蛋白是一类以盐溶性蛋白为主的蛋白质群，是具有重要生物学功能的结构蛋白质，与肉制品的流变学特性如保水性、弹性、质地等有着密切的关系［2］。另据报道，浊度可以反映蛋白质的聚集程度。溶液中蛋白质聚集形成颗粒的数目越多、体积越大，浊度就越大［3］。肌原纤维蛋白的聚集程度影响其形成凝胶的结构［4］，进而影响肉类产品的品质。蛋白质的溶解度影响其热诱导凝胶性质、起泡性以及肉品的保水性［5］，同时溶解度可作为制品过熟程度的判断指标［6］。溶液的温度、pH 和离子强度能够影响蛋白质的聚集程度和溶解度，进而影响其功能性质和加工特性。由于鲍鱼腹足中肌原纤维蛋白含量很高，其性质与鲍鱼产品的品质有直接关系，因此，对其性质进行研究有重要意义，但关于鲍鱼腹足肌原纤维蛋白性质的研究国内外未见报道。本文将研究鲍鱼腹足肌原纤维蛋白所包含蛋白质的种类，并考察温度、pH 以及离子强度对鲍鱼腹足肌原纤维蛋白溶液浊度和溶解度的影响，以期对鲍鱼的加工以及鲍鱼产品开发提供理论依据。

1 实 验

1.1 实验材料

鲜活皱纹盘鲍，（75±5）g，购于大连长兴海鲜市场。

化学试剂与标准蛋白：磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、二硫苏糖醇（DTT）、无水硫酸铜、氢氧化钠、酒石酸钾钠等均为分析纯；蛋白质分子质量标准品，宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 主要仪器与设备

T25数显匀浆机，德国IKA；Z-323K 冷冻离心机，德国HERMLE；UV-2100型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司；pH 计，上海鹏顺科学仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；JM-250型电泳仪，大连捷迈科贸有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的提取方法

鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的提取参照Paredi等［7］的方法进行改进。将鲍鱼去壳、去内脏，取腹足闭壳肌及其相连部分洗净，切碎，打浆30s，加入其20～30 倍体积（mL／g）的水洗液（40 mmol／L NaCl，0.5 mmol／L DTT，1 mmol／L MgCl2，10mmol／L 的 磷 酸 盐 缓 冲 液pH 7.0），在5 000r／min匀浆4min。为了防止匀浆液过热，每匀浆40s暂停20s。所得匀浆物在10 000r／min（4℃）离心5min。将所得沉淀按照上述步骤再重复处理两次，向第3次所得沉淀中加入10倍体积（mL／g）的提取液（0.6mol／L NaCl，10mmol／L 的磷酸盐缓冲液pH 7.0），4 000r／min匀浆4min，然后匀浆物在13 500r／min（4 ℃）离心25 min，所得上清即为鲍鱼腹足肌原纤维蛋白溶液。

1.3.2 蛋白质质量浓度的测定方法

双缩脲法［8］测定蛋白质质量浓度，用牛血清蛋白（BSA）作为标准蛋白。

1.3.3 鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的SDS-PAGE方法

参照Laemmli［9］的方法对鲍鱼腹足肌原纤维蛋白进行SDS-PAGE 分析。将鲍鱼腹足肌原纤维蛋白与样品缓冲溶液按体积比1∶1 混合，100℃水浴加热5min。选取12%的分离胶和5%的浓缩胶。电泳时初始电压为90V，当样品前沿刚好进入分离胶后将电压提高到120V，电泳时间约3h。使用Gel-Pro analyzer 4软件分析电泳图像。

1.3.4 鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的热处理方法

将一定量的肌原纤维蛋白溶液加入到配有旋盖的玻璃试管中，旋紧旋盖后置于水浴锅中加热。用温度计检测试管中心温度，控制升温速率为1 ℃／min，使样品的温度从30 ℃升高到90 ℃。考察温度点为30、40、50、60、70、80和90℃，当温度达到相应值时立即取出试管并流水冷却。

1.3.5 浊度测定方法

参照文献［10］的方法，调整肌原纤维蛋白质质量浓度为2.0mg／mL，在不同条件处理后静置过夜，测定A350。

1.3.6 溶解度测定方法

测定浊度后的蛋白溶液在4 ℃、13 500r／min下离心25min，参照文献［11］的方法测定蛋白溶解度。

2 结果与讨论

2.1 鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的SDS-PAGE结果

通过SDS-PAGE 可知鲍鱼腹足肌原纤维蛋白主要含有肌球蛋白重链（201ku）、副肌球蛋白（96 ku）、肌 动 蛋 白（46 ku）和 原 肌 球 蛋 白（38ku），质 量 分 数 分 别 为21.7%、35.8%、27.4%和6.6%，如图1 所示。此结果与Ehara等［12］对鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的研究结果接近。另外，鲍鱼腹足肌原纤维蛋白与脊椎动物［13-14］肌原纤维蛋白相比副肌球蛋白含量相对较高，这可能与物种差异有关。

图1 鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的组成Fig.1 The composition of abalone myofibrillar protein

2.2 温度对鲍鱼腹足肌原纤维蛋白浊度和溶解度的影响

在缓冲液pH 为7.0，离子强度为0.6mol／L（NaCl），蛋白质质量浓度为2.0 mg／mL 的条件下考察温度对鲍鱼腹足肌原纤维蛋白浊度和溶解度的影响，见图2。

图2 温度对鲍鱼腹足肌原纤维蛋白浊度和溶解度的影响Fig.2 Effect of heating temperature on turbidity and solubility of abalone myofibrillar protein

从图2可知，鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的浊度随加热温度升高而上升。30～40 ℃时，鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的浊度基本保持不变，说明蛋白还没有发生明显变性聚集。40～50 ℃时浊度明显上升，说明蛋白变性聚集程度急剧增加。Paredi等［15］报道扇贝肌球蛋白的变性温度为41.7～55.0 ℃，因此鲍鱼肌原纤维蛋白浊度在40 ℃时开始增加可能是由于肌球蛋白的变性聚集引起。温度达到50 ℃时，浊度（A350）达到1.0，说明溶液中已经产生明显的蛋白聚集物。50～90 ℃时，随加热温度升高浊度缓慢上升，说明蛋白聚集物的结构变得致密。因此，当升温速率一定时，聚集物生成过程中浊度的上升较聚集物结构变得致密过程中浊度的上升更为明显。

30～40 ℃时，鲍鱼腹足肌原纤维蛋白溶解度变化不明显，说明蛋白几乎没有发生变性。40～50 ℃时，溶解度急剧降低，说明蛋白急剧变性。50～90 ℃时，随加热温度升高溶解度缓慢降低，说明部分未变性的蛋白缓慢变性。加热促使鲍鱼肌原纤维蛋白空间结构发生变化，疏水基团暴露，暴露的疏水基团发生聚集，从而导致蛋白沉淀、溶解度降低。

2.3 pH 对鲍鱼腹足肌原纤维蛋白浊度和溶解度的影响

在离子强度为0.6 mol／L（NaCl），蛋白质质量浓度为2.0 mg／mL，温度为室温下（20～25 ℃）考察pH 对鲍鱼腹足肌原纤维蛋白浊度和溶解度的影响，见图3。从图3 可知，当pH 在4.0、4.5和5.0时，鲍鱼腹足肌原纤维蛋白溶液浊度较大（A350＞1.3）且有波动，说明蛋白发生了明显聚集而且聚集物的结构不均匀，费英等［4］同样发现在酸性条件下肌原纤维蛋白形成的凝胶不均匀且存在聚合物。pH 在5.5～6.0时蛋白浊度急剧下降，说明蛋白的聚集程度也急剧下降。pH 高于6.0时，蛋白基本没发生聚集，因此浊度较低且变化不明显。鲍鱼腹足肌原纤维蛋白在碱性和中性条件下基本不发生聚集，在酸性条件下聚集程度较大，pH 在5.5时聚集程度最大。

图3 pH 对鲍鱼腹足肌原纤维蛋白浊度和溶解度的影响Fig.3 Effect of pH on turbidity and solubility of abalone myofibrillar protein

pH 低于5.5 时，鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的溶解度较低，且随pH 升高溶解度变化不明显；pH 从5.5升高到6.0的过程中，溶解度急剧升高；pH 超过6.5以后，溶解度变化不大。通常当溶液的pH 靠近蛋白质等电点时，蛋白质所带净电荷减少、溶解度明显降低，另外pH 对猪肉［16］、鱼肉［17］的肌球蛋白二级结构变化有不同程度的影响，因此当溶液的pH 从6.0降低到5.5时，鲍鱼腹足肌原纤维蛋白所带净电荷和空间结构发生变化，导致溶解度降低。

2.4 离子强度对鲍鱼腹足肌原纤维蛋白浊度和溶解度的影响

在pH 为7.0，蛋白质质量浓度为2.0mg／mL，温度为室温（20～25 ℃）下考察离子强度（NaCl）对鲍鱼腹足肌原纤维蛋白浊度和溶解度的影响，见图4。从图4可知，离子强度从0.2 mol／L 升高到0.4mol／L的过程中，鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的浊度急剧下降；当离子强度大于0.4 mol／L时，随离子强度的增加浊度变化不明显。浊度的降低反映了蛋白质聚集程度的降低，因此鲍鱼肌原纤维蛋白在低离子强度下容易发生聚集，在高离子强度下聚集程度较低或者基本不发生聚集，这与徐幸莲等［11］对兔骨骼肌肌球蛋白溶液浊度的研究结果一致。

离子 强 度 从0.2 mol／L 升 高 到0.4 mol／L时，鲍鱼腹足肌原纤维蛋白的溶解度急剧升高；当离子强度大于0.4mol／L 时，随离子强度增加溶解度变化不明显。这与韩敏义等［18］研究兔肌球蛋白获知的溶解度变化趋势有相似性。

图4 离子强度对鲍鱼腹足肌原纤维蛋白浊度和溶解度的影响Fig.4 Effect of ionic strength on turbidity and solubility of abalone myofibrillar protein

3 结 论

（1）鲍鱼腹足肌原纤维蛋白主要由肌球蛋白、副肌球蛋白、肌动蛋白和原肌球蛋白组成，其中副肌球蛋白含量相对较高。

（2）鲍鱼腹足肌原纤维蛋白溶液浊度随温度升高而上升，随pH 和离子强度的升高而下降；溶解度随温度升高而降低，随pH 和离子强度的升高而升高。

（3）当 溶 液pH 高 于6.0，离 子 强 度 大 于0.4mol／L时，鲍鱼腹足肌原纤维蛋白溶解度较高。当温度高于50℃时，鲍鱼腹足肌原纤维蛋白溶解度较低。

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