酶法制备鲍鱼脏器呈味肽及呈味氨基酸

乔 路， 佟 伟 刚， 周 大 勇， 朱 蓓 薇

（1.大连工业大学 食品学院，辽宁 大连 116034；2.白城市产品质量检验所，吉林 白城 137000）

0 引 言

鲍（Haliotis）是名贵的水产珍品，具有丰富的营养价值和药用价值。长期以来，鲍的加工和食用主要以腹足为主，占鲍总重1／4左右的脏器大部分被丢弃，这不仅会造成环境污染，同时还是资源的极大浪费。研究表明，皱纹盘鲍脏器中蛋白质质量分数为40%以上［1］，并含有丰富的精氨酸、谷氨酸、色氨酸等人体所需氨基酸和多种微量元素［2］，具有很大的利用价值。本研究以皱纹盘鲍脏器为原料，优化了利用酶法制备鲍鱼脏器呈味肽及呈味氨基酸的条件，以期为鲍鱼脏器的高值化利用提供新的理论依据。

1 试 验

1.1 材料与仪器

鲍鱼脏器：大连獐子岛渔业集团股份有限公司提供。试验所用鲍鱼脏器干粉的化学组成：总蛋白57.17%，总糖16.36%，总脂11.5%，水分5.36%，灰分8.68%。

LG-1.0型真空冷冻干燥机，沈阳航天新阳速冻设备制造有限公司；8050 超滤搅拌器，Millipore France；甲醛，大连医药集团化玻公司；三氯乙酸，天津市光复精密化工研究所。

1.2 试验方法

1.2.1 原料预处理

将新鲜鲍鱼脏器洗净，匀浆，冻干至含水9%以下，粉碎，过20目筛后备用。

1.2.2 鲍鱼脏器的蛋白酶酶解

分别用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶水解鲍鱼脏器干粉，酶解条件见表1。产物用分子质量10ku的超滤膜进行超滤分离，取分子质量小于10ku的肽组分（AVHs-I）进行后续试验。

表1 3种酶的试验条件Tab.1 Experimental conditions for the three proteases

1.2.3 蛋白酶酶解条件的优化

1.2.3.1 单因素试验

中性蛋白酶单因素试验的基本条件为：酶加量2 500 U／g，反应温度50 ℃，底物质量分数8%，pH 7.0，水解时间3h。改变其中一个条件，固定其他条件以分别考察酶加量、水解温度、底物质量分数、pH 和水解时间对水解度的影响。各因素 水 平 梯 度 分 别 为：酶 加 量2 000、2 500、3 000、3 500、4 000U／g；反应温度35、40、45、50、55 ℃；底物质量分数2%、4%、6%、8%、12%；pH 6.0、7.0、7.5、8.0、8.5；水解时间2.0、2.5、3.0、3.5、4.0h。水解完成后，在沸水浴中保持10min灭酶，采用甲醛滴定法测定水解度。研究各因素对于中性蛋白酶应选取的大致范围，并以此为基础确定响应面各个水平值，从而使得测定结果更加准确、有效、实用。

1.2.3.2 响应面分析

分析单因素试验结果，将酶解温度定为45 ℃，时间定为3h，以水解度为指标，做酶加量、pH 值和底物质量分数的三因素三水平中心组合设计响应面试验［3］。

1.2.4 测定方法

1.2.4.1 化学组成的测定

蛋白质的测定：微量凯式定氮法［4］。

总糖的测定：菲林试剂法［5］。

水分的测定：根据GB／T 5009.3—2003，采用直接干燥法。

脂肪的测定：索氏提取法［6］。

灰分测定：根据GB／T 5009.4—2003，采用马弗炉灼烧法。

1.2.4.2 酶活力的测定

采用Folin-酚法测定酶活力［7］。

1.2.4.3 水解度的测定［8］

采用甲醛滴定法［9］测定鲍鱼脏器水解液中的酸溶氮的质量。

总氮：凯氏定氮法。

水解度=酸溶氮的质量／总氮质量

1.2.4.4 肽得率的测定

采 用 三 氯 乙 酸（TCA）沉 淀 法［10-11］结 合

FoLin-酚法［12］测定肽得率。

肽得率= （m2-m1）／（m0-m1）

式中，m1为反应前蛋白液中TCA 可溶性蛋白质量，mg；m2为蛋白酶解液中TCA 可溶性蛋白质量，mg；m0为总蛋白质量，mg。

1.2.4.5 谷氨酸等鲜味氨基酸相对质量分数的测定

走过小桥，穿过公路，穿过绿地，看着他们三人身手矫健地翻越铁栅栏，特别是泰森，黑熊一样笨重的身躯翻越栅栏时像山羊一样轻捷灵敏。进院子后，他们在一楼的大门口鼓捣了一会儿，门便悄无声息的打开了。看着他们幽灵一般鱼贯而入，门悄无声息的掩上，我突然有了决定——赶快跑！

由军事医学科学院国家生物医学分析测试中心色谱实验室完成。

1.2.5 感官评定分析

采用排序检验法［13］测定。

2 结果与讨论

2.1 酶的选择

2.1.1 鲍鱼脏器水解产物的水解度及肽得率

根据表1的试验条件进行酶解，各酶解产物的主要化学组成以及水解度和肽得率结果如表2所示。

表2 鲍鱼脏器3种蛋白酶酶解产物的水解度及肽得率信息Tab.2 Hydrolysis degree and peptide yield derived from abalone viscera digested with the three proteases

从表2中可以看出，中性蛋白酶酶解产物的蛋白质质量分数、水解度及肽得率在3个酶解产物中均属最高，其次是木瓜蛋白酶酶解产物和胰蛋白酶酶解产物。根据表中数据不难发现，酶解产物的水解度高，其肽得率也高，二者呈正相关。

2.1.2 鲍鱼脏器水解产物的鲜味氨基酸

从表3中可以看出，原料中富含天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸等3种鲜味氨基酸。原料经水解超滤后，各产物的鲜味氨基酸质量分数会稍有增加。中性蛋白酶酶解产物鲜味氨基酸质量分数明显高于来源于其他两个蛋白酶的酶解产物。

表3 鲍鱼原料和3种酶解产物AVHs-I的呈味氨基酸组成Tab.3 Flavor amino acid contents of the abalone viscera and the three AVHs-I derived from different proteases

2.1.3 排序检验感官评价结果

本试验将中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶制备的呈味肽及呈味氨基酸按照排序检验法进行比较，试验结果见表4。

对表4进行统计并进行样品秩次与秩和分析。使用Friedman检验，求出统计量F：

式中，J，品评人数；P，样品数；R1，R2，…，RP，每种样品的秩和。

表4 评价员的评价结果Tab.4 Evaluation results of evaluators

用F 与Friedman 秩和检验近似临界值比较［15］，计算所得F 值大于表中（显著水平α=0.01）对应的临界值，即9.75＞9。从而得出结论：中性蛋白酶酶解产物具有更好的口感效果。

崔春等［16］的报道指出，水解度较低时酶解液无明显风味或以特征苦味为主，如果提高水解度会将大部分蛋白质降解为氨基酸和小分子肽，酶解液会呈现出典型的鲜味。同时，蛋白酶的专一性水解与呈味也有很大关系，若水解液以亲水性肽为主则呈现鲜味［17］。

中性蛋白酶酶解鲍鱼脏器所获酶解产物的水解度及鲜味氨基酸含量均最高，而且其口感也最好，因此该酶被选为工具酶进行酶解条件的研究。

2.2 工具酶酶解条件的优化

2.2.1 单因素试验

本试验利用中性蛋白酶作为工具酶，以水解度为指标，得到的单因素试验结果见图1。中性蛋白酶在单因素试验环节确定的最适酶加量为3 000U／g，最适酶解温度为45℃，最适底物质量分数为4%，最适pH 为7.5，最适酶解时间为3h。

2.2.2 响应面分析

以水解温度、底物浓度和pH 为自变量，以水解度为因变量。用Minitab15软件设计试验方案并对试验结果进行分析，结果见表5。

表5 响应面分析试验结果Tab.5 Experimental results of response surface methodology

将试验数据输入软件可得回归模型方程：

图1 中性蛋白酶水解鲍鱼脏器的单因素试验结果Fig.1 Results of single-factor experiment

对回归方程进行方差分析，结果见表6。模型整体为显著水平，表明回归模型与试验结果数据吻合良好。由响应面结果的方差分析可知，方程一次项、二次项的影响都是显著的，交互项作用影响不显著，故交互项可以省略，也可以看出各具体试验因子对响应值的影响不是简单的线性关系。

通过降维分析方法将多元问题转化为一元或二元问题，便于分析单因素及双因素与蛋白水解度的效应关系，并用图形表示，可获得形象图像。将任一因素固定在“0”水平，得到另外两个因素的交互影响结果，见响应曲面图2。

表6 回归方程的方差分析Tab.6 Analysis of variance of regression equation

图2 3个因素对酶解效果的交互影响Fig.2 Interaction influences of three factors on enzymolysis

比较3组图可知，影响酶解效果的显著性大小顺序依次为温度、底物质量分数和pH。

对拟合模型进行响应优化，得最优酶解条件X1=0.160 9、X2=0.115 8、X3=-0.689 3，即温度46.0 ℃，底物质量分数3.12%，pH 7.8，酶加量3 000U／g，作用时间3h。在此条件下，理论水解度为29.81%，实测水解度为29.98%。

3 结 论

中性蛋白酶是制备鲍鱼脏器呈味肽及呈味氨基酸的最佳工具酶，其酶解产物的水解度及肽得率分别为22.59%和44.96%，其天冬氨酸、谷氨酸和丙氨酸质量分数分别为114.77、142.75 和62.83mg／g。排序检验感官评定法确定中性蛋白酶酶解产物的口感最好。

通过单因素试验和响应面分析确定中性蛋白酶的最佳酶解工艺条件为：温度46.0 ℃，底物质量分数3.12%，pH 7.84，加酶量3 000U／g，反应时间3h。在此条件下理论水解度为29.81%，实测水解度为29.98%。

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