三七皂苷R1 的分离提纯

张 雁， 宋 建 国， 鱼 红 闪， 金 凤 燮

（1.大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 化工与材料学院，辽宁 大连 116034）

0 引 言

三 七［Panax notoginseng （Burk.）F.H.Chen］为五加科人参属植物，主要分布于我国云南、贵州、广西壮族自治区等省，以根和根茎入药，是我国名贵的中药材。传统医学认为三七具有散瘀止血，消肿止痛的功效［1］，现主要用于心脑血管系统疾病的治疗。皂苷类成分是三七的主要有效成分，迄今为止已从三七不同部位分离得到单体皂苷70多种［2］。这些皂苷成分大多为达玛烷型的20（S）-原人参二醇型和20（S）-原人参三醇型四环三萜类皂苷，但未发现含有齐墩果酸型皂苷，这与同属植物人参和西洋参有显著区别［3］。我国2010年版药典将人参皂苷Rb1、人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、三七皂苷Rl作为鉴别三七的指标成分［4］。因此，制备可作为对照品的三七皂苷R1单体对鉴别三七药材具有重要意义。近年有文献报道，三七皂苷R1对TNF-α引起的血管内皮损伤、过氧化所致大鼠海马神经元损伤有明显的保护作用［5-6］，提纯三七皂苷R1对其药理作用的进一步研究及相关药品的研发生产也具有重要意义。

在本实验室以往的研究中［7］，利用硅胶柱层析法分离三七中的主要皂苷成分时，三七皂苷R1和人参皂苷Re、Rd会被同时洗脱下来，不能获得纯净的三七皂苷R1。本研究利用大孔吸附树脂-硅胶柱层析法分步分离三七总皂苷，达到提纯三七皂苷R1的目的。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

标准品人参皂苷Rb1、Rd、Re、Rg1、Rh1、三七皂苷R1，由本实验室提供；三七根，云南省市售产品；大孔吸附树脂，南开大学化工厂生产；硅胶，青岛海洋化工厂生产；薄层层析板Silica Gel 60-F254，德国Merck公司生产；高效液相色谱仪，美国Waters产品；实验所用试剂均为分析醇。

1.2 方 法

1.2.1 三七总皂苷的提取

称取一定质量的三七根，将其粉碎，加入5倍体积甲醇浸泡3d，适当搅拌，滤纸过滤，收集滤液。上述甲醇浸提过程反复3次，合并提取液，浓缩。浓缩液用石油醚脱脂3次。脱脂后的溶液经水饱和正丁醇萃取4次，收集正丁醇相，浓缩干燥成粉末。将干燥粉末溶于75%乙醇后，上D-296大孔吸附树脂柱，脱色，用10倍柱体积84%乙醇洗脱皂苷，收集洗脱液，浓缩干燥得三七总皂苷。

1.2.2 大孔吸附树脂-硅胶柱层析法分离提纯三七皂苷R1

称取一定质量的三七总皂苷，用少量75%乙醇完全溶解，加适量去离子水稀释后，上样至柱体积为2L的AB-8大孔吸附树脂柱。待皂苷被充分吸附后，用2倍柱体积的去离子水洗去糖等水溶性杂质，依次用10 倍柱体积36%乙醇和5 倍柱体积84%乙醇梯度洗脱皂苷。将两个梯度的洗脱液分别收集，浓缩干燥，得含R1的皂苷组分和不含R1的皂苷组分。

称取一定质量含R1的干燥组分，用少量甲醇完全溶解，与80～100目硅胶混合均匀，水浴干燥，制成样品胶。采用干法装柱，首先填装16倍样品量的分离胶（300～400 目硅胶），真空泵抽实，再将样品胶加在分离胶上层，为保持柱面平整，在柱顶覆两层脱脂棉。以V（氯仿）∶V（甲醇）=8.5∶1.5 做流动相进行洗脱，按每瓶250mL收集洗脱液。薄层层析法（TLC）监测洗脱进程。根据TLC 结果，将相似的组分合并收集，浓缩干燥。

1.2.3 薄层层析法（TLC）

将皂苷溶于甲醇中，用毛细管吸取少量皂苷溶液，少量多次地点在薄层层析板的起始线上，风干后，置于层析缸中展开。展开剂到达层析板上缘时，取出，吹干，喷洒10%硫酸水溶液，加热显色。参照标准品斑点位置确定样品中所含皂苷成分。本研究中，检测AB-8大孔吸附树脂柱洗脱结果时，TLC展开剂选用V（正丁醇）∶V（乙酸乙酯）∶V（水）=4∶1∶2，此展开剂使R1与Rd的Rf值差值增大，易于辨别分离效果；监测硅胶柱层析洗脱进程时，TLC 展开剂选用V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶3∶0.5。

1.2.4 高效液相色谱法（HPLC）

采用高效液相色谱法检测三七皂苷。美国Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器，Empower 2色谱工作站，Knauer C 18色谱柱（5μm，250mm×3mm）。柱温35 ℃，体积流量0.6mL／min，按需要配制1mg／mL样品液，样品进样量10μL，检测波长203nm。乙腈-水梯度洗脱，洗脱条件如表1所示。

表1 HPLC洗脱条件Tab.1 The elution requirement of HPLC

2 结果与讨论

2.1 三七根总皂苷的提取

1 000g三七根经甲醇浸提，石油醚脱脂，水饱和正丁醇萃取，D-296大孔吸附树脂脱色，得到三七总皂苷粗品82.0g，得率为8.20%。采用HPLC检测三七总皂苷成分及含量。将提取获得的三七总皂苷粗品配制成2mg／mL甲醇溶液，在“1.2.4”所述的色谱条件下进行分析，检测结果如图1所示。由图1可知，三七根中主要含有Rg1、Rb1、R1、Rd、Re 5 种 皂 苷，另 外 还 含 有 少 量 的Rb3、Rc、Rh1等。按色谱峰面积计算各种皂苷的质量分数，结果如表2所示。

图1 三七总皂苷HPLC分析图谱Fig.1 Total ginsenosides in Panax notoginsengon HPLC

表2 三七根中的皂苷成分Tab.2 The proportion of ginsenoside in root of Panax notoginseng

由表2 可知，三七皂苷R1占总皂苷的11.36%。另外，总皂苷中含量最高的是人参皂苷Rg1，占总皂苷的44.15%。

2.2 大孔吸附树脂-硅胶柱层析法分离提纯三七皂苷R1

称量80.0g 三七总皂苷粗品，用800 mL 75%的乙醇完全溶解，加去离子水稀释5倍后，上样至AB-8大孔吸附树脂柱，TLC 检测样品吸附完全后，用4L去离子水洗去糖等水溶性杂质，依次用20L36%乙醇和10L84%乙醇梯度洗脱皂苷。TLC检测两个梯度的洗脱液，结果如图2所示。将两个梯度的洗脱液分别浓缩干燥，称重得，36%乙醇洗脱下40.0g 皂苷，84%乙醇洗脱下28.0g皂苷。

由图2可知，36%乙醇主要洗脱下原人参三醇类皂苷Rg1、R1、Re，其中R1和Re的Rf值相近；84%乙醇主要洗脱下原人参二醇皂苷Rb1、Rd和少量的原人参三醇皂苷Rg1、Rh1。表明通过AB-8大孔吸附树脂梯度洗脱，能将大部分的原人参三醇类皂苷与原人参二醇类皂苷分离，排除了原人参二醇类皂苷Rd对三七皂苷R1的干扰，为三七皂苷R1的进一步分离减少障碍。

称取上述36%乙醇洗脱组分（即含三七皂苷R1的组分）40.0g，制成样品胶，采用硅胶柱法进一步分离，以V（氯仿）∶V（甲醇）=8.5∶1.5作流动相进行洗脱，每瓶收集250mL。薄层层析法监测洗脱进程，根据TLC监测结果合并收集相似的组分。合并后各组分经TLC检测，结果如图3所示。

图2 AB-8大孔吸附树脂分离三七总皂苷的TLC图谱Fig.2 Separation of total ginsenosides by AB-8 macroporous adsorbent resin on TLC

图3 硅胶柱层析分离三七皂苷R1Fig.3 Separation of notoginsenoside R1by silica gel column on TLC

由图3可知，3号组分是较纯的三七皂苷R1，4号组分中主要为三七皂苷R1，混有部分Re；1号组分主要为Rh1和Rg1，2号组分为Rg1和R1的混合品，5号组分主要为Re，混有其他皂苷。将1～5号组分浓缩干燥，称量。结果如表3所示。

表3 洗脱皂苷收集表Tab.3 The separation and elution of saponins

由表3可知，收集编号为28～32 的3 号组分，浓缩干燥后得纯度较高的三七皂苷R11.27g，占硅胶柱层析样品量的3.16%，占粗总皂苷的1.55%。

采用HPLC法检测三七皂苷R1。取少量硅胶柱层析分离得到的3 号组分干粉，配制成1mg／mL甲醇溶液，在“1.2.4”所述的色谱条件下进行分析，检测谱图如图4所示。结果显示，三七皂苷R1单体纯度较高，达98.48%。

图4 三七皂苷R1 高效液相色谱图Fig.4 Notoginsenoside R1on HPLC

3 结 论

本实验从1 000g三七根中醇提获得三七总皂苷82.0g，得率为8.20%。高效液相色谱检测结果表明，三七皂苷R1占三七总皂苷的11.36%。利用大孔吸附树脂-硅胶柱层析法，对三七总皂苷进行两步分离。先用10倍柱体积36%乙醇洗脱吸附了80.0g总皂苷的AB-8大孔吸附树脂柱，得到40.0g含三七皂苷R1的皂苷组分；再将40.0g含三七皂苷R1的皂苷组分用硅胶柱层析法分离，得到三七皂苷R1单体1.27g，占硅胶柱上样量的3.16%，占三七总皂苷的1.55%，经HPLC检测三七皂苷R1纯度为98.48%。综上所述，大孔吸附树脂-硅胶柱层析法能有效地实现三七皂苷R1单体的分离，达到提纯该皂苷的目的。

［1］金凤燮，鱼红闪，张春枝，等.天然产物生物转化［M］.北京：化学工业出版社，2009：74-97.

［2］宋建平，曾江，崔秀明，等.三七根茎的化学成分研究（Ⅱ）［J］.云南大学学报：自然科学版，2007，29（3）：287-290.

［3］鲍建才，刘刚，丛登立，等.三七的化学成分研究进展［J］.中成药，2006（2）：46-49.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：11.

［5］ZHANG Hong-sheng，WANG Sheng-qi.Notoginsenoside R1inhibits TNF-α-induced fibronectin production in smooth muscle cells via the ROS／ERK pathway［J］.Free Radical Biology & Medicine，2006，40：1664-1674.

［6］次向明，张秋颖，王忠，等.黄芩苷、丹参酮ⅡA、三七皂苷R1对过氧化氢所致大鼠海马神经元损伤的保护作用［J］.中国中医基础医学杂志，2004，10（6）：34-36.

［7］石岭.丹参和三七参成分转化及分离纯化的研究［D］.大连：大连工业大学，2010.