人参皂苷Rf的分离提纯

2011-11-20 03:09飞,丹,闪,
大连工业大学学报 2011年3期
关键词:根须总皂苷硅胶

李 鹏 飞, 何 丹, 鱼 红 闪, 金 凤 燮

(大连工业大学 生物工程学院,辽宁 大连 116034)

0 引 言

人参皂苷Rf具有抗肿瘤,抗疲劳的功效,能够减少子宫收缩,且起到与脑神经细胞有关联的镇痛作用[1]。人参皂苷Rf是人参中的特有皂苷[2],常用来作为区分人参与西洋参、三七参等其他类别人参的重要指标[3-4]。因此,制备可作为对照品的人参皂苷Rf单体对鉴别人参药材具有重要意义。由于Rf这些特殊的性质,将其从人参总皂苷中分离提纯进行单独研究是非常必要的。本实验室先后对人参皂苷单体Re、Rg1进行了分离,但从未对人参皂苷单体Rf进行过研究。本论文采用甲醇浸提法提取人参根须中总皂苷,然后用硅胶柱层析法分离出人参皂苷Rf单体,为工业上大规模提取人参皂苷Rf提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

人参,人参皂苷标准品,薄层层析板Silica Gel-60-F254,层析用硅胶,高效液相色谱仪;色谱所用试剂为色谱醇,其他实验试剂均分析醇。

1.2 方 法

1.2.1 人参总皂苷的提取

将1 000g人参根须粉碎后用甲醇反复浸泡3次,过夜,每次甲醇用量为6L。合并浸提液浓缩干燥后用200 mL 石油醚反复脱脂3 次,脱脂后粉末溶解于适量去离子水中,然后用200mL水饱和正丁醇萃取3次,合并正丁醇层。水洗正丁醇层脱糖,最后将正丁醇层浓缩、干燥、收集、称重,得人参总皂苷。取少量干燥样品进行HPLC检测。

1.2.2 硅胶柱层析法

制备样品胶:将分离所得人参总皂苷用甲醇和少量氯仿溶解,加入2.5 倍样品质量的80~100目硅胶,水浴蒸干,将样品胶放入干燥皿中。

装柱:取20倍人参总皂苷样品质量的300~400目硅胶作为分离胶,用漏斗慢慢装入玻璃柱内,使其铺放均匀(其间抽实硅胶),再装入样品胶,最后在最上层放置脱脂棉,装柱完成。

洗脱:用纯氯仿通柱,再用V (氯仿)∶V(甲醇)=8.5∶1.5的氯仿-甲醇洗脱液进行洗脱,待检测出Rf完全分离后将洗脱液配比换为V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5继续洗脱。最后收集洗脱液,浓缩,蒸干得固体粉末。

1.2.3 薄层层析法(TLC)

分别取1mg人参皂苷标准品及人参皂苷样品溶于1mL 甲醇中,制成人参皂苷溶液。将点好样品的薄层板放入层析缸中展开,展开剂配比为V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶2.5∶0.5,显色剂为10%硫酸。根据标准品对照即可确定样品中的皂苷成分。

1.2.4 高效液相色谱法检测分离产品纯度

高效液相色谱,Waters 2695;色谱柱,Knauer(5μm,250mm×3mm);流动相A,乙腈;流动相B,水。流动相配比如表1 所示。配置样品质量分数为2%,用0.45μm 滤膜过滤后即得检测样品。柱温,35 ℃;进样量,10μL;检测波长,203nm;体积流量,0.6mL/min。

表1 HPLC检测的流动相条件Tab.1 Condition of mobile phase of HPLC

2 结果与讨论

2.1 提取人参根须总皂苷及其成分分析

按“1.2.1”提取人参总皂苷。将500g人参根须经甲醇浸泡提取,石油醚脱脂,正丁醇萃取,水洗脱糖后干燥称重,得人参总皂苷干燥粉末20.5g,提取率为4.10%。取干燥样品2mg,溶于1mL甲醇中进行HPLC检测,检测结果如图1所示。由图1可知人参根须总皂苷中含有人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rd,质 量 分 数 分 别 为43.7%、2.68%、9.02%、14.0%、13.1%、10.4%、7.11%。总皂苷中Rf质量分数较高,可进行分离提纯。

图1 人参总皂苷HPLC检测图谱Fig.1 Ingredients of total ginsenoside on HPLC

2.2 硅胶柱分离人参总皂苷中的Rf

采用硅胶柱层析法分离上述人参总皂苷中Rf单体。称取20.5g人参总皂苷样品,按方法“1.2.2”分离,洗脱液开始配比为V(氯仿)∶V(甲醇)=8.5∶1.5。洗脱液分瓶收集,每瓶体积为200mL,分瓶取样进行TLC 检测。待洗脱至55瓶时,Rf洗脱完全。洗脱液配比改为V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5。进行TLC检测,前64瓶TLC检测结果如图2所示。

图2 人参总皂苷硅胶柱分离成分TLC检测结果Fig.2 The total gingenoside separated by silica gel column on TLC

根据TLC检测结果,对含有相同组分的收集液进行合并处理,分别用旋转蒸发仪浓缩,水浴蒸干,称重,放入干燥的容器中保存。取少量蒸干后的样品,加入少量的甲醇溶解,再次进行TLC 检测,结果如图3所示。在硅胶柱层析分离中,1~17瓶中,除7、8瓶其他均无皂苷洗脱出来,所以TLC检测无皂苷条纹显示。人参总皂苷各洗脱组分收集情况见表2。由表2可知,20.5g人参根须总皂苷经硅胶柱分离后,得到较纯人参皂苷单体Rf 0.410g,在总皂苷中的得率为2.05%,在人参根须中总得率为0.082%。同时得到副产物人参皂苷单体Rg11.64g,得率为8.20%;皂苷Ra组0.350g,得率为1.75%。

图3 合并样品的TLC图谱Fig.3 The collected total ginsenoside on TLC

表2 人参总皂苷洗脱收集表Tab.2 Prepare for separation by silica gel column

2.3 HPLC检测分离人参皂苷单体的纯度

采用HPLC 方法检测分离后的人参皂苷Rf纯度。精密称取前上述分离获得的人参皂苷单体Rf、Rg1及皂苷Ra组各2mg,分别溶于1mL 色谱甲醇,过滤得2mg/mL的供试品。人参皂苷单体Rf的HPLC检测图谱如图4所示。

图4 人参皂苷Rf的HPLC图谱Fig.4 Ginsenoside Rf on HPLC

由图4可以看出,人参根须总皂苷经硅胶柱层析分离得到的人参皂苷Rf单体纯度较高,可达到93.0%。同时检测副产物Rg1纯度为81.0%,Ra组纯度为61.0%。

3 结 论

从500g人参根须分离提取得到20.5g人参总皂苷,提取率为4.10%,其中人参皂苷Rf的质量分数为9.02%。硅胶柱分离得到人参皂苷单体Rf 0.410g,在总皂苷和人参根须中的得率分别为2.00%和0.082%。同时得到人参皂苷Rg11.64g(8.20%);皂苷Ra组0.350g(1.75%)。经检测人参皂苷单体Rf的纯度为93.0%,副产物Rg1纯度为81.0%,Ra组纯度为61.0%。经分离后得到的Rf纯度较高,可为以后对Rf这种人参特有皂苷进行单独研究打下基础,并为工业上大规模提取人参皂苷Rf提供理论依据。

[1]金凤燮.天然产物生物转化[M].北京:化学工业出版社,2009,84:90-91.

[2]窦德强,靳玲,陈杰英.人参的化学成分及药理活性的研究进展与展望[J].沈阳药科大学学报,1999,16(2):15.

[3]何耀慧,林荣锋,陈剑平,等.人参、三七在复方芪术调经散中的高效液相色谱法鉴别[J].广州中医药大学学报:自然科学版,2009,26(5):468-470.

[4]李丽,刘春明,吴巍,等.高效液相色谱-电喷雾质谱联用法测定人参和西洋参的皂苷类成分[J].分析化学研究报告,2005,33(8):1087-1090.

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