EDRV和DIDS对急性缺血再灌注心肌组织活性氧水平的影响*

刘艳霞， 刘佳妮， 沈明志， 李 榕， 张荣怀， 翟雅莉， 赵 萌， 王跃民， 王晓明△

(第四军医大学1西京医院老年病科，2生理学教研室,陕西 西安710032)

EDRV和DIDS对急性缺血再灌注心肌组织活性氧水平的影响*

刘艳霞1， 刘佳妮1， 沈明志1， 李 榕1， 张荣怀1， 翟雅莉1， 赵 萌1， 王跃民2， 王晓明1△

(第四军医大学1西京医院老年病科，2生理学教研室,陕西 西安710032)

4, 4’-二异硫氰基芪-2, 2’-二磺酸； 再灌注； 活性氧；依达拉奉；心脏

心肌缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injuury,I/RI)的主要机制是活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的产生，其主要来源于线粒体的黄嘌呤氧化酶、吞噬细胞和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nicotine adenine dinucleotide phosphate oxidase,NADPH oxidase)[1]。ROS是诱导组织细胞损伤性死亡的关键分子。研究表明：用抗氧化剂治疗或者上调内源性抗氧化酶可以保护再灌注引起的损伤；转基因小鼠中的抗氧化蛋白质超氧化物歧化酶(superoxide dismutase ,SOD)的高表达时心肌梗死面积可显著减少[2]。我们前期研究发现，氯离子通道阻断剂 4,4’-二异硫氰基芪-2,2’-二磺酸( 4,4’- diisothiocyanostilbene-2, 2’-disulfonic acid ,DIDS)具有减轻心脏I/RI的作用[3-5]，且发现DIDS 、自由基清除剂依达拉奉(edaravone,EDRV)及两者联合使用均具有保护心肌的作用，那么，他们是通过什么途径起作用的？对组织中ROS有调节作用吗？作用机制如何？为此，本研究进行了上述问题的实验观察。

材 料 和 方 法

1材料

2方法

2.1心肌I/RI模型的制备及实验方案 将SD大鼠以30 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)经腹腔注射麻醉后，按常规方法制备大鼠I/RI(30 min/4 h)模型[6]：颈正中切口气管插管，连接呼吸机进行正压人工呼吸，经右颈总动脉插管至左心室记录左室压及其微分。开胸暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支起始段，以心电图上ST段抬高或T波高耸、心肌颜色变暗红色为结扎成功的标志。缺血30 min后，松开丝线，再灌注4 h。将40只SD大鼠随机分为5组：假手术(sham)组、心肌I/RI组、DIDS(I/RI+DIDS)组、EDRV组(I/RI+EDRV)组和DIDS+EDRV(I/RI+DIDS+EDRV)组，每组8只大鼠。于再灌注前，将EDRV按10 mg/kg经右颈动脉注入，持续注入时间为5 min[7]。于再灌注即刻,经股静脉以程控微量泵给予DIDS(14 mg/kg,4 mL·kg-1·h-1),持续2 h[3]。

2.2心肌细胞凋亡测定 用TUNEL凋亡检测试剂盒检测各组心肌组织中的凋亡细胞，严格按试剂盒说明书操作，样本切片在 1 h 内(避免荧光淬灭)于荧光显微镜下观察。本实验采用 Hoechst 33342 对全部细胞核进行衬染。

2.3血清SOD活性及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的检测 再灌注 4 h 结束时,从大鼠右侧颈总动脉取血 2 mL,室温放置30 min 后,3 000 r/min 离心20 min后用移液器取上清分装在 EP 管中，尽量避免倾倒，液氮速冻，-20 ℃ 冰箱保存。按照试剂盒说明书操作，用分光光度计检测SOD 活性及 MDA 含量。

3统计学处理

结 果

1心肌细胞凋亡测定

TUNEL法检测不同组大鼠I/R 4h心肌细胞凋亡指数结果见图1、表1。与sham组相比，其它 4 组心肌细胞凋亡指数显著高于sham组(Plt;0.05)；与I/RI组相比，DIDS组、EDRV组与DIDS + EDRV组的心肌细胞凋亡均明显降低(Plt;0.05)，DIDS和EDRV组间无显著差异(Pgt;0.05)，DIDS + EDRV组较DIDS或EDRV组有明显降低(Plt;0.05)，可见DIDS和EDRV均具有抑制心肌细胞凋亡发生的作用，联合使用时，其抑制作用强于二者单独使用。

Figure 1. Effects of EDRV or/and DIDS on myocardial apoptosis in acute ischemia- reperfusion injury.

表1 DIDS和EDRV及二者联合使用对大鼠心肌细胞凋亡的影响

2血清SOD活性及MDA含量的检测

不同组大鼠I/RI 4 h血清SOD活性及MDA含量见图2、3，I/RI 组、DIDS 组、EDRV 组及 DIDS + EDRV 组血清中 SOD 活性较sham 组明显降低，但 MDA 含量较 sham 组明显增加(Plt;0.05)；与 I/RI 组比，DIDS 组、EDRV 组及 DIDS + EDRV 组血清中 SOD 活性均明显增加(Plt;0.05)，但MDA 含量均明显降低(Plt;0.05)； DIDS 组与 EDRV 组相比，DIDS 组的 SOD 活性降低更显著(Plt;0.05), 但MDA 含量增高更显著(Plt;0.05)；而DIDS + EDRV组与 EDRV 组相比，DIDS + EDRV 组的 SOD 活性明显增高，但MDA 活性明显降低，但均无显著差异(Pgt;0.05)。

Figure 2. Effects of EDRV and DIDS on serum SOD activity after acute ischemia- reperfusion injury ±sE. n=8. *Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

Figure 3. Effects of EDRV and DIDS on serum MDA concentration after acute ischemia- reperfusion injury ±sE. n =8. *Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

Figure 4. Effects of EDRV and DIDS on ROS concentration in myocardial tissues after acute ischemia- reperfusion injury±sE. n =8. *Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

Figure 5. Effects of EDRV and DIDS on superoxide anion concentration in myocardial tissues after acute ischemia- reperfusion injury±sE. n=8. *Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

Figure 6. Effects of EDRV and DIDS on hydroxy free radical (OH·) concentration in myocardial tissues after acute ischemia- reperfusion injury±sE.n=8.*Plt;0.05 vs sham group；△Plt;0.05 vs I/RI group；▲Plt;0.05 vs EDRV group.

讨 论

氯离子是体内最丰富的阴离子，其调节主要受细胞膜上特异通道蛋白的功能性改变相关，它参与了调节细胞的增殖、发育、凋亡及细胞容积的变化等重要生理功能。我们前期从细胞及整体动物水平已经证实了氯离子通道阻断剂DIDS能够抑制I/RI心肌细胞的凋亡及改善心脏功能[3-5,9]，其保护心肌细胞与激活PI3K/Akt信号通路有关[4， 5]。众多研究证实I/RI是缺血性心血管疾病血管再通后加重组织器官损伤的主要机制，而活性氧的产生是引起细胞损伤的主要启动因子[1]。Qin等[8]报道梗死后心肌缺血/再灌注损伤与坏死区周围组织中细胞凋亡密切相关，用抗氧化剂治疗或者上调内源性抗氧化酶可有效保护再灌注引起的心肌损伤。同时，我们前期的研究也证实：在急性缺血/再灌注大鼠模型的再灌注前给予 ROS 清除剂-EDRV，能够改善心脏功能，减小缺血/再灌注损伤心肌凋亡的发生，进一步证明了活性氧簇在心脏缺血/再灌注损伤中的重要作用。

[1] Misra MK, Sarwat M, Bhakuni P,et al. Oxidative stress and ischemic myocardial syndromes[J]. Med Sci Monit，2009，15(10):RA209- RA219.

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EffectsofEDRVandDIDSonreactiveoxygenspecieslevelsinacuteischemia-reperfusioninjuredmyocardium

LIU Yan-xia1, LIU Jia-ni1, SHEN Ming-zhi1, LI Rong1, ZHANG Rong-huai1, ZHAI Ya-li1, ZHAO Meng1, WANG Yue-min2, WANG Xiao-ming1

(1DepartmentofGeriatrics,XijingHospital,2DepartmentofPhysiology,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China.E-mail:xmwang@fmmu.edu.cn)

4,4’-diisothiocyanostilbene-2, 2’-disulfonic acid; Reperfusion; Reactive oxygen species; Edaravone; Heart

1000-4718(2011)04-0648-05

R542.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2011.04.005

2010-10-02

2011-02-16

国家自然科学基金资助项目 (No.30770847; No.81070127)

△通讯作者 Tel:029-84775543;E-mail:xmwang@fmmu.edu.cn