肺炎嗜衣原体Pmp21蛋白原核表达载体的构建

刘良专 游晓星 徐磊 吴移谋

肺炎嗜衣原体Pmp21蛋白原核表达载体的构建

刘良专 游晓星 徐磊 吴移谋

目的 PCR扩增肺炎嗜衣原体多形态膜蛋白Pmp21基因，构建pGEX-6p-2／Pmp21原核表达载体。方法 筛选Pmp21优势抗原表位，PCR法扩增Pmp21目的基因；并亚克隆至pGEX6p-2原核表达载体；经PCR与测序鉴定。结果 软件分析选择Pmp21优势抗原表位编码基因的154bp～885bp位碱基序列，设计引物PCR法扩增得到目的片段；构建重组质粒经测序鉴定， BLAST比对与Genbank上登录序列完全一致。结论 成功构建pGEX-6p-2／Pmp21载体，为研究Pmp21在Cpn感染中的作用奠定基础。

肺炎嗜衣原体；Pmp21；载体

肺炎嗜衣原体多形态膜蛋白（polymorphic membrane proteins,Pmp）的发现是衣原体全基因序列分析的重大成果[1]。发现Cpn有21个基因编码Pmp1～Pmp21[2-4]，其中PmpD (Pmp21)引起了人们的广泛重视[5]。为此，本研究克隆Pmp21优势抗原表位，为探讨其在Cpn感染中的应用奠定实验基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、载体 Cpn AR39株、pGEX-6p-2载体南华大学病原生物学研究所保存。

1.1.2 主要试剂与试验动物 限制性内切酶、DNA 聚合酶均为MBI产品、 DNA标准、蛋白质标准MBI公司。

1.2 方法

1.2.1 Pmp6和Pmp21基因序列的获取 登陆互联网登陆（http://stdgen.northwestern.edu/），获取Pmp21碱基序列，其Gene ID为Cpn0963。

1.2.2 Pmp21蛋白优势抗原表位的预测 登陆互联网登陆http://www.expasy.org/tools/protscale.html,输入Pmp21的核苷酸序列，筛选Pmp21优势抗原表位。

1.2.3 原核表达载体pGEX-6p-2/ Pmp21的构建与鉴定 prime 5设计 PCR引物， P1 序列为 5’-CGC GGATCC TCTGCTCATGTTGAAGAGGC -3’， P2序列为5’- TTTTCCTTTT GCGGCCGC CACAATGGGTCACAACAATG-3’，引入 BamHI和 NotI 酶切位点及保护性碱基。PCR反应条件为：95℃ 3min预变性，95℃45s， 53℃ 30s，72℃2.5min，循环28次，72℃延伸8min 终止反应， 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分析，纯化后克隆到pGEX-6p-2上，并转化入E.coli BL21中，经PCR筛选和测序（上海生工公司)鉴定。

2 结果

2.1 Pmp6、Pmp21优势抗原表位预测结果

经Expasy软件分析Pmp21基因的抗原表位结果显示，其整个分子抗原性均较强，存在多个强抗原表位，其亲水性和可及性参数结果如图1、图2。

图1 亲水性分析

图2 可及性分析

2.2 Pmp21编码基因的PCR扩增

以重组质粒及Cpn AR-39株全基因组DNA为模板，PCR分别扩增Pmp21基因片段，1.0%的琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增出特异性目的基因与预期片段大小一致（图3）。

图3 PCR扩增Pmp6、Pmp21PCR产物1.5%琼脂糖电泳分析(1) 阴性对照； (2)阳性对照(756bp）； (3)DNA marker；(4) Pmp21 PCR 产物 (732bp）； (5)PCR鉴定产物

2.3 基因测序结果与Blast分析

将原核表达载体进行测序鉴定，并用Blast软件对测序结果与GenBank上登陆的目的序列进行比较分析，表明扩增的目的基因序列与GenBank公布的基因序列相同，且密码子读码框无移位。

3 讨论

本实验表明选用的Pmp蛋白有较强的免疫反应性和抗原性，且软件分析存在多个抗原优势表位；我们选取的基因片段高度保守，并与其他已知基因同源性低，在以后的实验中可以避免抗原之间的交叉反应，从而有利于提高实验方法的特异性和灵敏性；目前国内外尚无这种蛋白在Cpn感染中的应用研究报道[6]。为此，本研究克隆Pmp21优势抗原表位，为探讨其在Cpn 感染中的应用奠定实验基础。

本研究中所使用的克隆和表达载体pGEX-6P-2，其多克隆酶切位点含有BamHI/NotI，检索发现在本研究预测基因的完整序列中没有该酶切位点，从而选用该组限制性内切酶作为该基因克隆的工具酶。此外，由于使用该载体进行转化表达后的蛋白为GST融合蛋白，这为进一步分离纯化目的蛋白提供了依据。我们依据基因库提供的基因序列设计引物，且选择了双酶切方法，能使目的基因定向插入到pGEX-6P-2载体上。并使用不同的方法对重组体进行鉴定：起初通过PCR方法对转化后在选择培养基上生长的细菌克隆进行初步筛选，筛选到阳性克隆。再对筛选阳性克隆进一步培养后进行测序鉴定，并与基因库提供的基因序列进行比对，最后进一步证实克隆到载体中目的基因序列的正确性，为该蛋白的后续研究奠定了基础。

[1] Tanzer RJ, Longbottom D, Hatch TP, et al. Identification of polymorphic membrane proteins of Chlamydia psittaci 6BC[J]. Infect Immun, 2001,69(4):2428-2434.

[2] Grimwood J,Stephens RS. Computational analysis of the polymorphic membrane protein superfamily of Chlamydia trachomatis and Chlamydia pneumoniae[J]. Microb Comp Genomics ,1999,4(3):187-201.

[3] Campbell LA, Kuo CC, Grayston JT. Structural and antigenic analysis of Chlamydia pneumoniae[J]. Infect Immun,1990 , 58(1): 93-97.

[4] Vandahl BB, Pedersen AS, Gevaert K, et al. The expression, processing and localization of polymorphic membrane proteins in Chlamydia pneumoniae strain CWL029[J]. BMC Microbiol,2002,36(9):1-12.

[5] Maria SC, Luca B, Maurizio C，et al. Identification of immunoreactive proteins of Chlamydia trachomatis by western blot analysis of a two-dimensional electrophoresis map with patient sera[J]. Electrophoresis，1999,20(11):2269-2279.

[6] Sharma J, Zhong Y, Dong F, et al. Profiling of human antibody responses to Chlamydia trachomatis urogenital tract infection using microplates arrayed with 156 chlamydial fusion proteins[J]. Infect Immun, 2006,74(3):1490-1409.

10.3969/j.issn.1009-4393.2011.36.026

国家自然科学基金资助(No. 30870134/ c010902)

421001 南华大学病原生物研究所 （刘良专 游晓星 徐磊吴移谋）

吴移谋 E-mail:yimouwu@sina.com.cn