液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中的七种全氟有机物

罗海英，蔡依军，冼燕萍，吴玉銮，郭新东，陈意光

（广州市质量监督检测研究院，国家加工食品质量监督检验中心（广州），广东广州510110）

液相色谱-串联质谱法测定鱼肉中的七种全氟有机物

罗海英，蔡依军，冼燕萍，吴玉銮，郭新东，陈意光

（广州市质量监督检测研究院，国家加工食品质量监督检验中心（广州），广东广州510110）

建立了液相色谱-串联质谱检测鱼肉中七种全氟有机物残留的分析方法。通过优化和比较，样品选用甲醇均质提取，C18固相萃取小柱净化，以乙腈-5mmol/L乙酸铵为流动相经C8反相色谱柱分离后，采用多反应监测（MRM）负离子模式检测。阴性样品添加实验结果表明，特征离子相对强度比值稳定，基质效应干扰少，结合保留时间可实现准确的定性定量，方法检出限为0.01～0.03μg/kg（S/N=3），不同鱼肉基质样本添加水平在0.05～1.0μg/kg时，平均回收率为80.0%～120.0%，相对偏差（n=6）为2.9%～7.6%。

液相色谱-串联质谱，鱼，全氟有机物，测定

全氟有机物（PFCs）具有化学惰性和耐热性等优良性能，在20世纪50年代就被广泛用于工业品和日常生活用品。这一类物质具有持久性、生物累积性、毒性以及能长距离迁移的特性，是一种持久性的环境污染物［1］。生物体一旦摄取PFCs，很难通过生物体的新陈代谢而分解，长时间接触会对健康造成严重损失，最近欧洲食品安全局推荐了关于人体摄入全氟辛烷磺酸盐（PFOS）和全氟辛酸（PFOA）的耐受量，分别为150、1500ng/（kg bw·d）［2］。目前在世界各地采集的环境样品中，包括水源、多种野生动物血清及组织样品，甚至人类乳汁，都已检测出多种的PFCs。鱼类等水产品是人类重要的膳食成分，因此对这类样品中PFCs的分析和控制，对于人类健康和饮食安全具有重要意义。目前，国内外对PFCs的检测方法通常为液相色谱-质谱联用（HPLC-MS/ MS）［3-7］，针对不同基质的食品的萃取方法主要有：离子对试剂液液萃取法［3］、碱消解法［3］、酸消解法和甲醇直接提取法［4］，以弱阴离子（WAX）固相萃取小柱［8-9］净化。离子对试剂液液萃取法一般以缓冲盐溶液-叔丁基甲醚进行萃取，对于含油脂较多的肉类食品，会萃取出大量的油脂，难以进行后继的净化；消解法则需要16h以上的消解时间，前处理耗时长；另外，WAX萃取柱需要使用酸性溶液淋洗、氨水甲醇洗脱，操作稍显繁琐。本研究通过对不同的提取溶剂、固相萃取净化柱、流动相、液相色谱柱的比较和优化，选择以甲醇为提取剂对肉类样品进行均质提取，C18固相萃取小柱净化，液相色谱-串联质谱测定，建立了行之有效的鱼肉中七种全氟有机物残留的分析方法，本方法操作简便，提取效果稳定，杂质干扰少。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

全氟己酸（PFHxA）、全氟庚酸（PFHpA）、全氟辛酸（PFOA）、全氟壬酸（PFNA）、全氟癸酸（PFDA）、全氟十一酸（PFUnDA）、全氟辛烷磺酸盐（PFOS）七种标准品 纯度＞99.0%，sigma-aldrich；乙腈、甲醇、乙酸铵 色谱纯；超纯水（18.0MΩ）。

LD5-2A离心机 北京京立离心机有限公司；N-EVAP 112水浴氮吹仪 Organomation Associates公司，美国；WERKE T25 basci均质器 广州仪科实验室技术有限公司；MS2 Minshaker漩涡振荡器 广州仪科实验室技术有限公司；Milli-Q去离子水发生器 Millipore公司，美国；20孔固相萃取装置Waters公司，美国；液质联用仪 Agilent 1200液相色谱系统和AB API 4000 Q-Trap三重四极杆质谱（采用Turbo spray ESI电离源）；C18固相萃取小柱Phenomenex Strata C18-E，500mg/3mL，使用前加入3mL甲醇，3mL水活化。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理

1.2.1.1 提取 称取鱼肉样品5.00g（精确至0.01g）至50mL聚丙烯离心管中，加入15mL甲醇，用均质器于10000r/min均质30s，再以少量甲醇洗涤刀头，合并洗涤液。于4000r/min转速下离心5min，过滤后定容至25mL。从中准确吸取10mL提取液置于氮吹管中，置于40℃水浴吹氮至干。加入2mL水，漩涡振荡溶解残渣，待净化。

1.2.1.2 净化 把待净化液过C18固相萃取小柱，保持流速小于1mL/min，以3mL水冲洗小柱，弃去流出液。加入6mL甲醇洗脱，收集流出液于氮吹管中，40℃水浴吹氮至干，准确加入1.0mL流动相，漩涡振荡溶解残渣，过0.22μm有机滤膜，待测。

1.2.2 液质联用仪分析条件

1.2.2.1 标准工作液配制 分别称取适量的PFCs标准品，用甲醇配制成单标标准储备液。分别准确吸取适量的PFCs单标标准储备液，用甲醇配制成浓度为1mg/L的混合标准溶液。临用前用流动相（60+ 40乙腈+5mmol/L乙酸铵溶液）将1mg/L混合标准溶液稀释至所需的标准工作液。

1.2.2.2 色谱条件 色谱柱：Kromasil 100-5C8150mm×4.6mm（i.d.），5μm；流动相：乙腈和5mmol/L乙酸铵溶液，洗脱梯度见表1；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；进样量：20μL。

表1 流动相组成和梯度

1.2.2.3 质谱条件 离子源：ESI；离子源温度：400℃；电离电压（IS）：-4500V；检测模式：采用多反应监测（MRM）模式；辅助气、雾化气、气帘气、碰撞气：氮气，均经调试为最优值。7种PFCs的定性定量离子对见表2。

表2 PFCs的定性定量离子对

2 结果与讨论

2.1 样品提取条件的优化

参考相关文献［1-6］，对样品的提取条件进行优化。根据PFCs具有极性和非极性两种基团，本文以阴性鱼肉样品添加实验（即称取阴性样品5.00g，添加5μg/L PFCs混合标准溶液1mL，于室温下放置2h后进行实验处理），对比了正己烷、甲醇、水三种溶剂作均质提取。实验发现：正己烷提取液吹氮浓缩后，得到大量的动物油脂，影响净化的处理；水提取液较为混浊，提取率低，净化处理时容易堵塞SPE小柱；甲醇提取，蛋白质变性沉淀，动物油脂也不容易溶出，提取液澄清，吹氮浓缩后容易净化，7种PFCs的提取率稳定，回收率在85%～97%。所以，本文选择了以甲醇为提取剂，对样品进行均质提取。

为避免引入高背景值，实验全过程应该避免使用聚四氟乙烯材质的色谱管路和器皿，本研究所用器皿均为聚丙烯材料，色谱管路为全PEEK塑料管路。

2.2 样品的净化

本研究考察了HLB、MAX和C18（疏水端基封尾）三种固相萃取小柱对7种PFCs的回收情况。采用含有7种PFCs（均为2ng）的2mL水溶液过柱，然后进行检测。实验发现，MAX回收率为零，这可能由于MAX填料中的季胺基与PFCs中的羧酸基结合紧密，2%甲酸甲醇不容易把PFCs置换洗脱下来；C18的回收率较HLB的稍高，7种PFCs的回收率均达90%左右（见表4）。本研究最终选择C18柱作为样品净化的固相萃取柱。

2.3 不同液相色谱条件的比较

在本实验室的条件下，比较了C18和C8色谱柱。由于PFCs具有-（CF2-CF2）n-直链，在C18色谱柱上保留很强，表现为色谱峰保留时间过长、不稳定，拖尾严重；改用C8色谱柱，色谱峰拖尾现象有所改善，流动相中加入乙酸铵后，峰型对称、尖锐。

高浓度的盐会影响目标化合物的离子化效率，同时对质谱仪造成损害，因此本实验对乙酸铵的浓度进行优化。研究了乙酸铵浓度分别为 5、10、20mmol/L时对各分析物在Kromasil 100-5C8色谱柱的色谱行为的影响。实验发现：随着乙酸铵浓度的增加，各分析物的保留时间稍有延长，各色谱峰稍展宽，响应值下降。所以，优选5mmol/L乙酸铵为流动相，8min内即可完成7种PFCs的检测，并得到满意的灵敏度。

2.4 方法检出限与线性关系

以流动相稀释PFCs混合标准溶液至0.05、0.2、1.0、2.0、10.0μg/L，按本文仪器条件进行检测。以浓度x（μg/L）对峰面积y作PFCs标准曲线回归方程，线性方程、回归系数、方法检出低限见表3。7种PFCs标准溶液的总离子流色谱图见图1。

表3 PFCs的线性方程、回归系数、方法定量限

表4 样品中全氟有机物的回收率与相对标准偏差（n=6）

图1 7种全氟有机物标准溶液的总离子流色谱图

2.5 回收率与精密度

分别以阴性的含油脂较少的罗非鱼肉和含油脂较多的鳗鱼肉进行3个水平的加标回收实验。每种肉样品的加标量0.05～1.0μg/kg。每个加标水平取6个平行样，其回收率与精密度数据见表4。

3 结论

本文建立了鱼肉中7种全氟有机物（PFCs）残留的液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析方法，该方法前处理简单、回收率高、精密度好，方法检出限为0.01～0.03μg/kg，可适用于鱼肉中7种全氟有机物（PFCs）的确证检验。

［1］Giesy J P，Kannan K.Global distribution of perfluorooctane sulfonate and related perfluorinated compounds in wildlife［J］. Environ Sci Technol，2001，35（7）：1339-1342.

［2］European Food Safety Authority.Perfluorooctane sulfonate（PFOS），perfluorooctanoic acid（PFOA）and their salts Scientific Opinion of the Panel on Contaminants in the Food chain［J］.The EFSA Journal，2008，653：1-131.

［3］王杰明，王丽，冯玉静，等.液相色谱-质谱联用分析动物内脏和肌肉组织中的全氟化合物［J］.食品科学，2010，31（4）：127-131.

［4］王杰明，潘媛媛，史亚利，等.高效液相色谱-串联质谱法对奶粉、酸奶中全氟化合物的分析［J］.分析测试学报，2009，28（6）：720-724.

［5］Marilyn Stadalius，Paul Connolly，Karen L Empereur，et al.A method for the low - level（ ng/g） determination of perfluorooctanoate in paper and textile by liquid chromatography with tandem mass spectrometry［J］.Journal of Chromatography A， 2006，1123（1）：10-14.

［6］王利兵，吕刚，冯智劼，等.液相色谱-质谱/质谱法测定包装材料中的全氟辛酸及其盐类物质［J］.色谱，2007，25（1）：115-116.

［7］Amy D Delinskya，Mark J Strynara，Shoji F Nakayama，et al. Determination of ten perfluorinated compounds in bluegill sunfish（Lepomis macrochirus）fillets［J］.Environmental Research，2009， 109（8）：975-984.

［8］Taniyasu S，Kannan K，Man K S，et al.Analysis of fluorotelomer alcohols，fluorotelorner acids，and short and long chain perfluorinated acids in water and biota［J］.Journal of Chromatography A，2005，1093（1/2）：89-97.

［9］潘媛媛，史亚利，蔡亚岐.鱼、贝类等水产品中全氟化合物分析方法的研究［J］.分析化学，2008，36（12）：1619-1623.

Determination of seven perfluorinated compounds in fish by liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry

LUO Hai-ying，CAI Yi-jun，XIAN Yan-ping，WU Yu-luan，GUO Xin-dong，CHEN Yi-guang
（Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute，National Center for Quality Supervision and Testing of Cosmetics（Guangzhou），Guangzhou 510110，China）

A high performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometric（HPLCESl-MS/MS）method was established for the determination of 7 perfluorinated compounds（PFCs）in fish.The sample was extracted with methanol and cleaned up by C18SPE cartridges.7 PFCs were separated on a C8reversed-phase column using gradient elution with acetonitrile and 5mmol/L ammonium acetate.The tandem mass spectral acquisition was done in the negative electrospray ionization utilizing multiple reaction monitoring.Analysis of blank and fortified samples showed that the relative intensity of the PFCs identification ion pairs in various matrices was stable.Combining with retention time，the method could be used for accurate qualitative analysis.The LOD（S/N=3）was 0.01～0.03μg/kg.At the spiking levels of 0.05～1.0μg/kg，the average recoveries were 80.0%～120.0%，and the RSD for repeated measurements（n=6）was between 2.9%and 7.6%.

HPLC-MS/MS；fish；perfluorinated compounds（PFCs）；determination

TS207.3

A

1002-0306（2011）02-0325-04

2010-08-17

罗海英（1976-），女，高工，主要从事检测技术研究工作。

国家质量监督检验检疫总局科技计划项目（2008QK264）。