酶法合成咖啡酸叶黄素酯的研究

杨云裳，许建国，张应鹏，李春雷

（兰州理工大学石油化工学院，甘肃兰州730050）

酶法合成咖啡酸叶黄素酯的研究

杨云裳，许建国，张应鹏*，李春雷

（兰州理工大学石油化工学院，甘肃兰州730050）

以叶黄素和咖啡酸为原料，在脂肪酶Novo435的催化下，首次合成了咖啡酸叶黄素酯。研究了脂肪酶催化叶黄素与咖啡酸合成咖啡酸叶黄素酯的影响因素，考察了酶量、溶剂、体系水分、温度、时间等因素对酯化反应的影响。结果表明，适宜的工艺条件是：酶量10mg/mL，溶剂为氯仿，水含量10mg/g，温度40℃，反应时间24h，在上述条件下咖啡酸转化率可达88%。采用IR对目标产物的结构进行了表征。

咖啡酸，叶黄素，脂肪酶，酯化反应

叶黄素分子中存在共轭双键，共轭双键对氧是极不稳定的，特别纯的晶体更容易被氧化破坏。许多物理、化学生物因素都影响叶黄素的稳定性，例如氧、光辐射、高温、酸等［1］。据有关文献报道［2］，叶黄素在未避光保存条件下60d后其含量仅占原来样品的45%，而暴露空气中的叶黄素在60d后其叶黄素质量占原来样品中叶黄素质量的9.7%，叶黄素的不稳定性限制叶黄素的开发利用。据文献报道，叶黄素酯的生物利用度大于纯叶黄素［3］。本文将叶黄素与咖啡酸合成咖啡酸叶黄素酯，可以大大提高叶黄素的稳定性，咖啡酸叶黄素酯在人体内水解成叶黄素和咖啡酸，同时满足人们对咖啡酸的需求。咖啡酸具有广谱的抑菌作用以及抗病毒、抗蛇毒、抗氧化［4］等药理作用。传统化学方法合成咖啡酸叶黄素酯，反应温度高，不利于叶黄素的稳定，而酶催化法具有反应条件温和，产物选择性高等优点。本文以咖啡酸、叶黄素作为底物，考察各因素对于酯化反应的影响，并对反应条件进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

固定化脂肪酶（Novo435） 诺维信（中国）生物技术有限公司；咖啡酸、叶黄素、丙酮、乙醇、甲苯、氯仿、正己烷 均为分析纯。

硅胶（100～200目） 青岛海洋化工有限公司；分子筛（4Å） 上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 咖啡酸叶黄素酯的合成 准确称取叶黄素56mg（0.1mmol）和咖啡酸36mg（0.2mmol）（摩尔比为1∶2），置于10mL具塞锥形瓶中，加入1.0mL脱水的氯仿，然后加入10mg脂肪酶（Novo435），充入氮气，于40℃气浴摇床下，避光振荡反应12h，然后加入15mg活化的4Å分子筛，再继续反应12h停止。

1.2.2 合成反应式 见图1。

图1 叶黄素与咖啡酸合成咖啡酸叶黄素酯的反应式

1.2.3 咖啡酸转化率的计算

式中：AV1：原料酸值；AV2：产物酸值。

2 结果与讨论

2.1 咖啡酸叶黄素酯的红外（IR）分析

对硅胶柱层析分离纯化得到的咖啡酸叶黄素酯作红外分析，结果见图2。3452cm-1处的强吸收峰为咖啡酸上-OH的吸收峰，1739cm-1处的强吸收峰为酯C=O的伸缩振动峰，是酯的特征吸收峰。以上分析说明，咖啡酸和叶黄素在脂肪酶的催化下已经发生酯化反应，生成了咖啡酸叶黄素酯。

图2 咖啡酸叶黄素酯的红外图谱

2.2 酶用量对反应的影响

在叶黄素加量为20.1mg，叶黄素与咖啡酸摩尔比为1∶2，加入氯仿1.0mL，反应温度为40℃，反应时间为24h条件下，考察酶用量对转化率的影响，结果见图3。

图3 酶用量对转化率的影响

由图3可知，随着酶量增加，反应速度加快，酯化率提高。但酶量达10mg/mL后，酶量进一步增加，酯化率增加缓慢，这是由于过多的酶使反应初始生成的副产物水增加，过多的水会使反应向负反应进行，并且可能导致酶失活［5］，所以酶量为10mg/mL较合适。

2.3 初始加水量对反应的影响

水对脂肪酶的影响有两个方面：一方面，酶需要少量的水以保持活性的三维结构状态，水可以保持催化部位的整体性，催化部位的极化、蛋白质的稳定；另一方面，水含量过高使酶构象柔性过大，酶构象将向疏水环境下热力学稳定的状态变化，引起酶结构的改变和失活，同时又限制了疏水性底物在酶分子附近的溶解性。只有最适水量才能使酶表现出最大活力［5］，如图4所示，加水量为10mg/g比较合适，既保持酶活性的三维结构状态，又促进反应进行。

2.4 有机溶剂对反应的影响

在使用不同的酶或者在不同的反应体系中，最适于使用的有机溶剂也是不同的。有机溶剂影响酶催化的途径有三种：一是有机溶剂与酶直接发生作用，通过干扰氢键和疏水键等改变酶的构象，从而导致酶的活性被抑制或酶的失活；二是有机溶剂和能扩散的底物或产物相互作用，影响正常酶催化反应的进行；三是有机溶剂还可以直接和酶所需的必需水相互作用。一般认为在非水介质中添加亲水性或和水互溶性的有机溶剂对反应不利，因为它们会夺取酶周围微环境的必需水，从而使酶失活，所以选择的有机溶剂疏水性越强越好［6］。如图5所示，氯仿比较合适。

图4 初始加水量对转化率的影响

图5 有机溶剂对转化率的影响

2.5 反应温度对反应的影响

固定化酶Novozyme435在100℃仍保持较高的酶活。为此在其它条件不变的情况下，只改变反应温度，观察其对转化率的影响，结果见图6。随温度的升高，转化率增加，但温度过高（＞60℃）对叶黄素的稳定不利［2，8］，实验表明在40℃比较合适。

图6 反应温度对转化率的影响

2.6 反应时间对酯化反应的影响

反应时间对酯化反应的影响见图7，可看出反应的转化率随着反应时间的延长而提高，但30h后转化率的增长趋势不明显，可能由于反应时间过长，酶的机械损耗越大，活力丧失，影响酯化反应进行［9］。所以总体时间控制在24h即可。

图7 反应时间对转化率的影响

3 结论

本文通过酯化反应，利用固定化脂肪酶催化叶黄素与咖啡酸合成咖啡酸叶黄素酯，并对影响此反应的各种因素进行了系统的研究。反应经初步优化得到的条件为：酶量10mg/mL，溶剂为氯仿，水含量10mg/g，温度40℃，反应时间24h，在上述条件下咖啡酸转化率可达88%。

［1］徐任生.天然产物化学［M］.北京：科学出版社，2004：3-23.

［2］杨云裳，张海霞，李春雷，等.万寿菊叶黄素的超声提取工艺研究［J］.食品研究与开发，2007，128（1）：97-99.

［3］张来新.从小蓟中提取止血药成分咖啡酸［J］.中成药，2002（10）：807-808.

［4］张艳，惠伯棣.叶黄素单体与酯的生物接近度比较［J］.中国食品添加剂，2008（5）：81-86.

［5］石红旗，林学政，缪锦来，等.溶剂体系酶催化酸解反应合成富含共轭亚油酸甘油酯的研究［J］.中国食品学报，2004（4）：257-265.

［6］曹淑桂.有机溶剂中酶催化研究的新进展［J］.化学通报，1995（5）：5-11.

［7］夏咏梅，王远征.脂肪酶催化合成甘油单硬脂酸酯［J］.日用化学工业，1999（6）：19-21.

［8］ZHENG Guo，YAN Sun.Solvent-free production of 1，3-diglycerirle of CLA：strategy consideration and protocol design［J］.Food Chemistry，2007，100：1076-1084.

［9］ Matthias Bergen，Manfred P，Schneider.Enzymatic esterification of glycerolⅡ.lipase-catalyzeed synthesis of regioisomerically panel（3）-rac-monoacylglycerols［J］.J Am Oil Chem Soc，1992，69：961-965.

Lipase-catalyzed synthesis of caffeic acid lutein ester

YANG Yun-shang，XU Jian-guo，ZHANG Ying-peng*，LI Chun-lei
（School of Petrochemical Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050，China）

The caffeic acid lutein ester was first synthesized by lutein and caffeic acid under lipase condtion.The effects of enzyme concentration，solvent，the ratio of water to substrates，reaction temperature and reaction time on the esterification were investigated.lt was showed that the optimized conditions were：enzyme concentration 10mg/mL，the ratio of water to substrates 10mg/g，solvent was chloroform，reaction temperature 40℃，reaction time 24h.The conversion rate was up to 88%when the esterification was carried on under the optimal conditions.The product stucture was analyzed by lR analysis.

caffeic acid；lutein；lipase；esterification

TS202.3

A

1002-0306（2011）02-0283-03

2009-12-28 *通讯联系人

杨云裳（1972-），女，博士，副教授，研究方向：生物有机化学。