制备乳脂肪球膜磷脂-维生素A脂质体的工艺优化

郭晨峰，张 微，刘 宁，*

（1.东北农业大学国家乳业工程技术中心，黑龙江哈尔滨150086；2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

制备乳脂肪球膜磷脂-维生素A脂质体的工艺优化

郭晨峰1，2，张 微1，2，刘 宁1，2，*

（1.东北农业大学国家乳业工程技术中心，黑龙江哈尔滨150086；2.东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，食品学院，黑龙江哈尔滨150030）

目的：制备可添加于婴儿液态配方乳的乳脂肪球膜磷脂-维生素A脂质体，并优化其制备参数。方法：本实验采用薄膜水合-高压均质法，应用乳脂肪球膜磷脂为膜材，制备维生素A脂质体，在单因素实验基础之上，探讨制备脂质体过程中磷脂浓度、主药与磷脂比例、胆固醇与磷脂比例、维生素E占磷脂百分比浓度、反应温度等制备因素对形成脂质体后包封率的影响规律。采用二次旋转正交组合实验方法设计实验，经SAS软件与Matlab软件处理数据得到配方原料指标和反应温度对脂质体包封率的影响。结果：优化得到制备脂质体工艺参数：磷脂浓度7.43%，磷脂与主药比例28.95∶1，磷脂与胆固醇比例为6.53∶1，维生素E占磷脂百分比浓度为0.83%，反应温度59.58℃，得到优化后最高包封率为88.77%，脂质体在扫描电子显微镜下观察，其超微结构为球状囊泡。结论：本实验首次以乳脂肪球膜磷脂作为膜材包埋维生素A制备脂质体，将传统的薄膜水合法与高压均质法相结合，成功制备出可添加于婴儿食品的可食性脂质体。

乳脂肪球膜磷脂，维生素A，薄膜水合-高压均质，脂质体

对于婴儿来说，最理想的食物就是母乳，母乳是 大自然最好的食物。然而在发达和发展中国家已经有越来越多的婴儿依赖于配方乳喂养，牛乳等或对其确定的修饰已经很大程度地应用于婴儿喂养［1］。鉴于维生素A对视力、免疫系统，以及神经系统的有益作用，对婴儿的发育来说充分摄入维生素A是非常重要的，所以应用药剂学补充维生素A可以减少一些传染性疾病和意外事件的发生。强化食品是另一个预防维生素A缺乏的办法，但是由于多种原因，强化不是直接的。首先，维生素A积累到高水平是剧毒的，所以强化食品要避免维生素A摄入过量。其次，维生素A在水相系统中难溶，例如饮料和高水分含量的食品。最后，维生素A在多数环境条件下极不稳定，这个问题影响了食品和药品的补充途径。在强化食品的制作、传输和贮存过程中可能发生大量维生素A的损失。而为了避免维生素A的损失而增加强化水平是不可取的，因为它存在着维生素A摄入过量的潜在风险［2］。脂质体在营养中最早的应用是受到母乳的启发。在最近的母乳电子显微研究中，研究结果表明作为母乳的微结构成分，脂质体在提供营养稳定等方面发挥着不可替代的作用［3］。制药工厂中使用的大豆和鸡蛋磷脂大量的花费已经限制了他们在食品体系中的商业用途。像所有的磷脂材料的天然来源一样，来源于酪乳中的乳脂肪球膜（milk fat globule membrane，MFGM）衍生的成分包括很多不同类型的磷脂。附有磷脂头基的链脂肪酸也在不同的磷脂源材料之间变化并且乳脂肪球膜衍生的组分要比它们的大豆类似物更趋于高度饱和。这种乳脂肪球膜磷脂材料的独特构成（特别是鞘磷脂类）可能会导致脂质体性能的不同以及有利于为消费者提供营养［4］。Thompson［5］等应用高压均质法以乳脂肪球膜磷脂为膜材制备出空白脂质体。本研究以乳脂肪球膜磷脂为膜材，应用薄膜水合-高压均质法制备维生素A脂质体。主要研究了制备过程中各不同参数对包封率的影响规律，从而优化乳脂肪球膜磷脂维生素A脂质体的配方和反应温度等工艺参数，将传统的薄膜水合法与高压均质法相结合，明显地改善了脂质体的物理性状。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乳脂肪球膜磷脂 复合脂质700，新西兰恒天然研究中心；维生素A醋酸酯（VA）、维生素E Sigma；咪唑 天津市科密欧科技有限公司；NaN3天津市福晨化学试剂厂；泊洛沙姆 德国BASF公司；胆固醇 天津市博迪化工有限公司；自制超纯水。

NS1001L型高压微射流均质机 意大利 Niro Soavi公司；H-7650透射电子显微镜 日本日立；TDA-8002水浴锅 天津市泰斯特仪器有限公司；ZFQ85B旋转蒸发仪 上海医械专机厂；KQ32000DB型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；高速分散器 宁波新芝生物科技股份有限公司；离心超滤管 上海百赛生物；圆底烧瓶，移液器等。

1.2 实验方法

1.2.1 脂质体的制备 按照不同比例称取一定量的乳脂肪球膜磷脂、维生素A醋酸酯、维生素E、胆固醇溶解于无水乙醇，置于圆底烧瓶中。将圆底烧瓶置于水浴中，在旋转蒸发仪上减压蒸发除去乙醇，直至乙醇蒸发完毕。加入咪唑缓冲液，振摇使薄膜溶解，形成乳白色溶液，将此溶液置于高速剪切器中处理（150r/s）即得较均匀溶液。样品通过高压均质机在103MPa下循环3次。

1.2.2 包封率的测定 用离心超滤法结合RP-HPLC（反向-高效液相色谱法）测定。

1.2.3 粒径的测定 采用动态光散射粒度仪测定脂质体的粒径分布。

1.2.4 数据处理 SAS软件回归的方法。最优方案采用Matlab中fmincon函数寻优的方法。

在单因素实验基础上，根据影响脂质体包封率的五个因素：磷脂浓度、主药与磷脂比例、胆固醇与磷脂比例、维生素E占磷脂百分比浓度、反应温度为自变量，以脂质体包封率为响应值进行实验研究，实验因素水平编码表见表1。

表1 实验因素水平编码表

2 结果与分析

2.1 各反应因素对脂质体包封率的影响

应用二次旋转正交组合实验设计方法，实验设计及结果见表2。用SAS软件回归得到包封率方程：

Y1=84.11333+2.571667X1+1.2275X2+1.6775X3+ 1.305X4+5.095X5-2.395X1X2-1.95X1X4-1.04375X1X5-1.488958X2X2+1.1425X2X3-1.843958X3X3+1.72625X3X5-4.315208X4X4+2.64625X4X5-2.761458X5X5

其中，X1、X2、X3、X4、X5取水平值。

对方程分析可以得到各因素对脂质体包封率的影响。

由表3可知，从F值可以看出各因素贡献率为：X5＞X1＞X2＞X3＞X4。即反应温度＞磷脂浓度＞磷脂∶主药＞磷脂∶胆固醇＞维生素E占磷脂百分比浓度。根据各因素对包封率的贡献率可以看出，反应温度和磷脂浓度对包封率影响比较显著，这与应用大豆磷脂作为膜材包封脂质体的贡献程度有所区别，原因可能是乳脂肪球膜磷脂与大豆磷脂在成分组成和捕集效率上的不同所致。该模型 R2= 94.78%，Y1（包封率）最优值为88.77%。

应用Matlab寻优方法对回归模型进行分析，寻找最优结果是当磷脂浓度为7.43%，磷脂∶主药= 28.95∶1，磷脂∶胆固醇=6.53∶1，维生素E占磷脂比例0.83%，反应温度为59.58℃时，包封率有最优值为88.77%。由图1可以得到交互项的响应面图。

2.2 验证和对比实验

在二次旋转正交组合设计实验得到的最优反应条件下，为了实验操作简便，将各实验反应条件参数按如下数值进行操作：磷脂浓度为7.5%，磷脂∶胆固醇=29∶1，磷脂∶胆固醇=7∶1，维生素E占磷脂比例0.80%，反应温度为60℃时，重复5个平行样，求平均值，测定得到包封率的平均值为87%，误差为2%，可以认为优化所得结果可信。

表2 实验设计及结果

图1 响应面图

表3 回归与方差分析结果

2.3 脂质体经过高压均质前后粒径的变化

应用薄膜水合法制备的乳脂肪球膜磷脂维生素A脂质体在形成初期经常出现相对浑浊、不均一等物理性状。经预实验研究发现，若直接将脂质体进入高压均质机循环，会由于溶液内存在不均匀性状而对高压均质机造成损耗，所以将应用薄膜水合法制备出的脂质体通过高速分散器分散剪切50s后上样高压均质机进行高压剪切循环。经过高压均质机处理的脂质体样品澄清，均一，性质相对稳定。由图2、图3可知，经过高压均质机处理后的脂质体样品平均粒径明显小于未经高压均质机处理的脂质体样品，且粒径分布比较均匀。

图2 应用薄膜水合法制备乳脂肪球膜磷脂维生素A脂质体的粒径分布

2.4 应用扫描电子显微镜对冻干脂质体进行微观结构的观察分析

将最优条件下应用薄膜水合法制备的脂质体先通过高速分散器分散剪切50s后上样高压均质机在103MPa压力下进行高压剪切循环。得脂质体样品后，在样品中加入浓度为15%的海藻糖作为冻干保护剂进行冷冻干燥（预冻方式为-18℃预冻24h）制得冻干脂质体。采用扫描电镜（Scanning Electron Microscopy，SEM）观察冻干脂质体的超微结构。置于扫描电镜下观察，拍照。工作参数为：加速电压5kV，物镜孔径20μm。将冻干脂质体经扫描电镜得到照片如图4所示，冻干脂质体经过放大2500倍后可以看到，脂质体表面较光滑，分布比较均匀，呈球状囊泡结构。

图3 应用薄膜水合-高压均质法制备乳脂肪球膜磷脂维生素A脂质体的粒径分布

图4 冻干脂质体扫描电镜照片

3 结论

在单因素实验的基础之上，以磷脂浓度、磷脂与主药比例、磷脂与胆固醇比例、维生素E占磷脂百分比浓度和反应温度为自变量，以脂质体包封率为因变量，采用二次旋转正交组合实验方法设计实验，用SAS软件和Matlab软件处理数据，优化得到最佳制备参数为磷脂浓度7.43%，磷脂与主药比例28.95∶1，磷脂与胆固醇比例为6.53∶1，维生素E占磷脂百分比浓度为0.83%，反应温度59.58℃，所得最高包封率值为88.77%。本研究在薄膜水合法基础之上建立了薄膜水合-高压均质法，有效降低脂质体平均粒径，并使脂质体粒径分布比较均匀，提高脂质体物理稳定性，从而开发制备出较高包封率，较低粒径的可食性脂质体。

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Optimization of technology for preparing vitamin A liposomes from milk fat globule membrane phospholipids

GUO Chen-feng1，2，ZHANG Wei1，2，LIU Ning1，2，*
（1.Northeast Agricultural University，National Dairy Industry Engineering and Technique Center，Harbin 150086，China；2.Northeast Agricultural University，Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，College of Food Science，Harbin 150030，China）

Objective：To produce the vitamin A（VitA）liposomes from milk fat globule membrane（MFGM）phospholipids which were added into infant liquid laboratory milk and optimize the parameter of the product. Methods：VitA liposomes MFGM was produced using the thin film hydration-high pressure homogenization method，and MFGM phosphatide as film material.Based on the single-factor experiment，the influencing rule of phosphatide concentration，the ratio between phosphatide concentration and principal agents，phosphatide concentration and cholesterol，the percentage of Vitamin E in phosphatide concentration and reaction temperatures and other preparation factors were discussed.The optimal technical conditions were investigated by the quadratic regression rotatable orthogonal design，and using SAS and Matlab to disposal data.Results：The phosphatide concentration was 88.77%，the ratio of phosphatide and principal agent was 28.95∶1，the ratio of phosphatide and cholesterin was 6.53∶1，the percentage concentration of VitE was 0.83%，temperature was 59.58℃，and the ultramicrostructure of the liposome was sphere vesicle.Conclusions：This study confirmed that the method of thin film hydration-high pressure homogenization could be used in producing VitA liposomes MFGM which were added into infant food.

milk fat globule membrane phospholipids；vitamin A；thin film hydration-high pressure homogenization；liposomes

TS201.1

B

1002-0306（2011）02-0195-04

2010-02-02 *通讯联系人

郭晨峰（1983-），男，硕士研究生，研究方向：脂质体在婴儿食品中应用。

国家863计划项目（2008AA10Z331）；黑龙江省“十一五”攻关课题（GB07B407）。