紫菜中类菌胞素氨基酸种类的确定及提取条件优化

许志恒，张朝辉，李八方，靳 肖，陈伯虎，李平林

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

紫菜中类菌胞素氨基酸种类的确定及提取条件优化

许志恒，张朝辉*，李八方，靳 肖，陈伯虎，李平林

（中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）

类菌胞素氨基酸（MAAs）是小分子、水溶性化合物，具有抗紫外辐射功能。采用紫外光谱和质谱分析，确定了福建产条斑紫菜中所含的MAAs类化合物为Porphyra-334和Shinorine；采用单因素实验和正交实验确定了紫菜中MAAs类化合物的最佳提取工艺条件为：提取液初始pH2.0，提取时间1.5h，提取温度45℃，料液比为1∶8。在最佳提取工艺条件下Porphyra-334和Shinorine的提取率分别为5.124mg/g和3.941mg/g。

紫菜，MAAs，种类确定，提取条件优化

近年来，随着环境污染的加剧，大气臭氧层不断遭到破坏，到达地面的紫外光辐射（尤其是UV-B）越来越强烈［1］。UV-B是太阳辐射引起皮肤晒斑，免疫能力低下和皮肤癌的主要因素［2］。因此，寻找天然无毒害的高效抗紫外剂成为研究的热点。MAAs类化合物最初由Leach从真菌中分离得到，此后相继在多种水生生物中发现［3］。MAAs是以环己烯酮为基本骨架，与不同类型氨基酸通过胺缩合作用形成的一大类水溶性物质［1］。由于共轭双键和不同侧链上活性基团的存在，在310～360nm的紫外光区具有强的吸收能力［4］。研究发现，在蓝藻中，MAAs能阻挡胞质光子量的3/10，MAAs含量高的蓝藻细胞较不含或少含MAAs的细胞对320nm为中心的UV辐射的抗性大约高25%［5］。哺乳动物内脏不能吸收MAAs，但目前已发现培养的人皮肤细胞能对MAAs类化合物中常见的Shinorine进行吸收［6］。到目前为止，从海洋生物中发现了大约有20余种MAAs，在褐藻、红藻中的分布最为广泛［7-10］。其中红藻门是MAAs量最高和密度最大的藻类植物［11-12］。2008年，我国紫菜产量仅次于日本、韩国，居世界第三位，且产量还在逐年增长。福建海面每年都有大量天然和人工养殖紫菜未进行有效的加工利用。因此，本文选择福建产条斑紫菜为研究对象，分析紫菜中MAAs化合物的种类和最佳提取条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

条斑紫菜（Porphyra yezoensis） 福建地区出产；乙醇、盐酸、氢氧化钠 均为分析纯；冰乙酸 色谱纯，天津市科密欧试剂厂。

FW100型万能粉碎机 天津泰斯特；SHA-B型恒温震荡水浴箱 国华；BR4i型冷冻离心机 法国Jouan公司；LABOROTA4001型旋转蒸发器HeidolpH；HP1100高效液相色谱系统 美国惠普公司；ZD-2型pH计 雷磁；UV-2550型紫外可见分光光度计 Shimadzu。

1.2 实验方法

1.2.1 MAAs类化合物提取路线 紫菜烘干→粉碎→过筛→称重→水提→离心→合并上清液→醇沉→冷冻变性→过滤→减压蒸馏→冷冻干燥→冻干粗品

1.2.2 标准品的制备 取冻干粗品10g，定容于100mL容量瓶中，45μm无机膜过滤，滤液于液相色谱制备标准品，液相色谱条件：色谱柱：Zorbax SB-C18柱（5μm packing；250×4 mm I.D.）；流动相：A相：甲醇，B相：0.2%乙酸溶液（1∶9）；流速1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：100μL。将MAAs的吸收峰分别收集（如图1所示），收集液减压冷冻干燥，取冻干样品配制成标准溶液，保存在-20℃冰箱中备用。

图1 MAAs液相图谱

1.2.3 MAAs化合物种类确定 紫外-可见分光光度计测定MAAs化合物的水溶液在200～800nm波长的吸光值，确定其最大紫外吸收波长，ESI-MS是用Q-TOF Ultima Global GAA076 LC质谱仪测试，确定其分子量。

1.2.4 MAAs含量测定 计算出标准溶液的浓度，将已知浓度的标准溶液和样品提取液分别通过高效液相色谱分析，比较提取液与标准液的峰面积，从而计算出样品中MAAs物质的含量。

1.2.5 单因素实验 以提取过程中MAAs的提取率为目标，以提取温度、提取时间、料液比和初始pH为影响因素进行单因素实验。提取方法参见1.2.1，检测方法参见1.2.4。

1.2.6 正交实验 在单因素实验的基础上，选择初始提取液pH、提取时间、提取温度进行L9（34）正交实验，正交实验的因素水平表见表1，对正交实验结果进行分析，确定最优实验条件。提取方法参见1.2.1，检测方法参见1.2.4。

表1 正交实验因素水平表

2 结果与分析

2.1 标准品紫外、质谱分析

由图2可知，MAAs化合物的最大紫外吸收波长为334nm。

图2 MAAs化合物的紫外扫描图谱

由图3所示，化合物a的［M+H］+为m/z= 347，其二级质谱（图 4）和 Porphyra-334完全一致［13］，因此，可确定化合物a结构为Porphyra-334；由图5得知，化合物b的分子量比化合物a少14，结合二级质谱和文献，推测化合物 b为 Shinorine。Porphyra-334和Shinorine的结构如图7、图8所示，化合物Porphyra-334和Shinorine的摩尔吸光系数分别为ε334=4.23×104M-1cm-1和εShinorine=4.47×104M-1cm1［12］。

图3 化合物a的一级质谱图

图4 化合物a的二级质谱图

图5 化合物b的一级质谱图

2.2 提取条件单因素实验

2.2.1 提取温度对提取率的影响 由图9可知，在初始pH7.0，提取时间2h，料液比1∶10的条件下，当温度低于45℃时，Porphyra-334和Shinorine的提取率随着温度的升高而增加，继续提高温度，提取率则呈下降趋势。可能是因为随着温度的升高，氢键更易断裂，MAAs的渗透、溶解、扩散速度也加快，因而MAAs物质更易于从原料中溶出，但过高的温度容易使Porphyra-334和Shinorine上的活泼基团与原料中的其他物质发生反应，从而使Porphyra-334的结构部分破坏而降低提取率，因此认为提取的最佳温度为40～50℃之间。

图6 化合物b的二级质谱图

图7 Shinorine

图8 Porphyra-334

图9 提取温度对MAAs提取率的影响

2.2.2 提取时间对提取率的影响 由图10可知，在初始pH7.0，提取温度45℃，料液比1∶10的条件下，提取率随着提取时间的增加而增大，当提取时间大于2h后，提取率无明显变化，因此确定1.5～2.5h为最佳的提取时间。

2.2.3 料液比对提取率的影响 由图11可知，在初始pH7.0，提取温度45℃，提取时间2h的条件下，当料液比小于1∶8时，Porphyra-334和Shinorine的提取率随着料液比的增加而提高，当料液比大于1∶8时，提取率上升并不明显，考虑到节约成本的因素，确定最佳料液比为1∶8。

2.2.4 初始pH对提取率的影响 由图12可知，在提取温度45℃，提取时间2h，料液比为1∶8的条件下，Porphyra-334和Shinorine在酸性环境中随着pH升高，提取得率逐渐下降，当pH升高至碱性环境下，提取得率开始上升，pH升至10.0时提取得率再次下降。由此可得出，pH=1.5～2.5为最佳的提取pH。推断是由于Porphyra-334和Shinorine各含有两个羧基基团和一个亚氨基基团，在强离子环境中容易溶出，所以强酸环境利于Porphyra-334的提取，强碱环境同样有利于MAAs物质的溶出，但碱性过高，MAAs物质不稳定。在pH为12时，40℃加热，紫菜中的MAAs仅需5h左右就完全分解；在80℃加热条件下，10min就达到完全分解状态［14］。

图10 提取时间对MAAs提取率的影响

图11 料液比对MAAs提取率的影响

图12 pH对MAAs提取率的影响

2.3 Porphyra-334和Shinorine正交实验结果

从表2和表4极差值（R）得出，RA＞RB＞RC＞RD，所选三个因素对水提液中 Porphyra-334和Shinorine提取率影响的重要顺序为初始pH＞提取时间＞提取温度，三个因素的极差值均大于空列的极差，证明实验所选的因素的影响均大于未考虑因素，实验设计是合理的，得出从条斑紫菜中提取Porphyra -334和Shinorine的最佳工艺条件为A2B2C2，即初始pH为2.0，提取时间1.5h，提取温度45℃，在此条件下进行验证实验，得Porphyra-334和Shinorine的提取率分别为5.124mg/g和3.941mg/g。从表3和表5方差分析的结果可以看出，提取条件A（初始pH）对提取液中Porphyra-334和Shinorine含量的影响极显著，B（提取时间）、C（提取温度）两个因素对提取物中Porphyra-334和Shimorine含量的影响显著。

表2 L9（34）Porphyra-334提取率正交实验结果

表3 正交实验方差分析结果

表4 L9（34）Shinorine得率正交实验结果

表5 正交实验方差分析结果

3 结论

3.1 采用紫外光谱和质谱分析，确定了福建产条斑紫菜中所含的MAAs类化合物为Porphyra-334和Shinorine。

3.2 通过单因素实验和正交实验，确定了Porphyra-334和 Shinorine的最佳提取条件为：水提液初始pH2.0，提取时间1.5h，提取温度45℃，料液比为1∶8。在最佳提取条件下，Porphyra-334和Shinorine的提取率分别5.124mg/g和3.941mg/g。

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Species identification and optimization of extraction conditions of mycosporine-like amino acids in Porphyra yezoensis

XU Zhi-heng，ZHANG Zhao-hui*，LI Ba-fang，JIN Xiao，CHEN Bo-hu，LI Ping-lin
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

Mycosporine-like amino acids（MAAs）are small，water-soluble compounds with the function of serving as screens against ultraviole（tUV）radiation.Using UV spectrum and mass spectrometry analysis，the MAAs from Porphyra yezoensis of Fujian Province was identified as Porphyra-334 and Shinorine.On the basis of single factor experiments and orthogonal array design experiments，four crucial extraction parameters such as extraction temperature and time，material/water ratio and initial pH value，were optimized for maximizing yield of MAAs from Porphyra yezoensis.Results showed that the optimum conditions were as follows：initial pH2.0，extraction for 1.5h，temperature 45℃ and material/water ratio of 1∶8（m/V）.Under such conditions，the actual extraction value of Porphyra-334 and Shinorine content reached to 5.124mg/g and 3.941mg/g，respectively.

Porphyra yezoensis；MAAs；species identification；optimization

TS255.1

B

1002-0306（2011）02-0187-04

2010-02-02 *通讯联系人

许志恒（1983-），男，硕士研究生，主要从事海洋活性物质的研究。

国家自然科学基金项目（30771674）；教育部重点项目（109099）。