嵇 豪 蒋冬花 周 琴 汪鹏荣 董夏梦 蔡琪敏
(浙江师范大学化学与生命科学学院,金华 321004)
D001阳离子交换树脂分离红曲霉发酵液中γ-氨基丁酸的研究
嵇 豪 蒋冬花 周 琴 汪鹏荣 董夏梦 蔡琪敏
(浙江师范大学化学与生命科学学院,金华 321004)
研究了红曲霉发酵液中的γ-氨基丁酸(GABA)分离纯化工艺。对3种脱色剂进行筛选,D101树脂对红曲发酵液具有最高的脱色率和GABA得率。分别以静态和动态吸附-解析方法考察D001离子交换树脂对GABA的最优分离条件,结果表明:脱色发酵液pH下上样,上样流速为1 BV/h,采用水和2 mol/L氨水两步洗脱,洗脱液浓缩后结晶为透明针状,GABA的总得率为45.4%。
γ-氨基丁酸 红曲霉发酵液 D001阳离子树脂 分离
γ-氨基丁酸(GABA)是一种广泛存在于动植物中的一种非蛋白质氨基酸,由谷氨酸经谷氨酸脱羧酶催化转化而来,是存在于哺乳动物脊髓、大脑中的重要的抑制性神经递质,具有突触后抑制作用,可通过突触后膜超极化、减少离子内流,降低细胞代谢及氧消耗等机制,是突触后神经元处于保护性抑制状态,并可通过突出前抑制减少谷氨酸的释放,从而减少灌注区神经元的死亡[1-2]。报道的GABA生理功能基本与抑制性神经递质有关,主要包括降血压功能,促生长功能,促进生殖,治疗癫痫,抗衰老等[3]。
目前GABA的制备方法主要有化学合成法和生物合成法[4]。其中生物合成法生产主要是利用微生物技术,通过筛选优良高产的安全菌种,发酵生产GABA制剂,可以认为是天然食品添加剂,我国卫生部于2009年将食品级GABA确定为新资源食品用于食品生产加工。食品级GABA主要以谷氨酸钠为原料经乳酸菌发酵,再分离纯化得制品。红曲是我国传统具有药食两用的发酵产品,现代研究证明红曲所具有的降压作用主要是由红曲霉的次级代谢产物GABA所引起的。红曲霉的高度安全性为GABA的生产提供了另一条可靠的途径[5]。本文试图通过使用阳离子交换树脂对红曲霉发酵液中的GABA进行分离纯化,为食品级GABA的商业生产提供一定的技术支持。
1.1 材料
活性炭:浙江省金华市医药公司;D001阳离子交换树脂,D101,D301大孔吸附树脂:西安蓝晓科技有限公司;GABA标准品:SIGAMA公司;高产GABA红曲霉发酵液(6 g/L)[6]:浙江师范大学微生物研究室。
1.2 主要仪器设备
RE-52B旋转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;SHZ-D循环水式多用真空泵:河南省予华仪器厂;BT600-2J蠕动泵:保定兰格恒流泵有限公司;100GPDRO反渗透纯水仪:上海和泰仪器有限公司;3.0 cm×50 cm玻璃层析柱:海门市盛邦实验仪器厂。
1.3 试验方法
1.3.1 红曲霉发酵液预处理
取红曲霉发酵液沸水浴10 min后12 000 r/min离心15 min[7],取上清液4℃冰箱保存备用。
1.3.2 GABA含量和色价的测定
采用改良纸层析法测定 GABA含量[8]。按0.004 g/mL加入显色剂茚三酮到展开剂中,取5 μL发酵上清液点样,GABA标准品做参比。采用新华一号层析纸展开后于90℃下显色10 min。将待测样和标准品斑点剪下,用0.1%硫酸铜∶75%乙醇=2∶38的洗脱液洗脱,于520 nm处比色测定。平行3次,取平均值。另配置不同浓度的GABA标准液,按上述方法洗脱比色,以GABA浓度对A520绘制标准曲线,GABA浓度可根据吸光度大小由标准曲线查得。
GABA损失率=(脱色前GABA含量-脱色后GABA含量)/脱色前GABA含量×100%
脱色率=(脱色前色价-脱色后色价)/脱色前色价×100%
取发酵液上清液,用去离子水适当稀释后以去离子水为参比在505 nm下测吸光度。
发酵液色价=OD505×稀释倍数
1.3.3 树脂的预处理
以去离子水浸泡树脂洗去大量泡沫,乙醇浸泡后漂至上清液澄清,再用去离子水洗至无醇味。2 mol/L NaOH浸泡6 h后水洗至中性,再用2 mol/L HCl浸泡6 h水洗至中性,最后将树脂浸泡于去离子水中备用[9]。
1.3.4 静态吸附试验
将一定初始浓度的GABA加入250 mL的锥形瓶中,再各加入一定量的树脂,用NaOH或HCl调节发酵上清液pH值,恒温振荡至平衡。吸附平衡后,液相浓度由改良纸层析法确定,吸附相浓度由下式计算[9]:
式中:q为平衡吸附量/mg/每克湿树脂;V为溶液体积/L;c0为GABA初始质量浓度/g/L;ce为GABA平衡时的质量浓度/g/L;W为离子交换树脂质量/g。
1.3.5 动态吸附与洗脱
将已经过预处理的发酵液,调至一定的pH值,用蠕动泵控制一定的流速上样,同时用分部收集器对流出液分部收集,测定其中的GABA含量。以流出液体积为横坐标,ce/c0为纵坐标,绘制穿透曲线。
配制一定浓度的洗脱剂,蠕动泵恒速上柱,分部收集器收集流出液,测定流出液GABA含量。以洗脱液体积为横坐标,GABA浓度为纵坐标,绘制洗脱曲线。
2.1 红曲发酵液的脱色
红曲色素是红曲霉的主要次级代谢产物之一,工业上利用红曲霉液体深层发酵生产红曲色素,常作为食品添加剂应用于食品工业[10]。本试验所采用的高产GABA红曲霉X27产红曲色素能力良好,发酵液色价达到22.4 U/mL,因此从发酵液中分离纯化GABA的首要任务是将色素脱除。分别以大孔树脂D101、D301和活性炭颗粒作为脱色剂,从脱色结果上看,以D101大孔树脂作为脱色剂,在添加量30%以上时脱色效果显著,脱色率达到90%以上。活性炭作为常用的脱色剂,脱色效果较为显著,但由于其不易再生、成本高,且脱色要求温度高,GABA损失率大。综合上述优缺点,选用30%的D101对发酵上清液进行脱色处理。
图1 脱色剂对脱色率及GABA损失率的影响
2.2 pH对D001交换容量的影响
pH是影响离子交换平衡关系的重要因素。GABA是两性电解质,其净电荷取决于自身等电点及溶液的pH值。理论上选择一个酸性环境,GABA主要呈阳离子状态,有利于同阳离子树脂的交换[11]。在静态吸附试验中,酸性条件下,树脂保持一个较大的交换容量,pH在5~7之间,树脂的交换容量达到最大值,之后随着pH的升高交换容量快速下降。由于树脂中的H+与GABA发生交换,导致交换体系的pH值下降;而经过脱色的发酵液主要成分为GABA(pI=7.5)及其前体物质谷氨酸(pI=3.22),当体系的pH下降,谷氨酸质子化易与GABA发生竞争吸附,导致交换容量降低。因此对GABA和谷氨酸的分离需要在动态吸附过程中进一步考察。红曲霉为嗜酸腐生真菌,因此其发酵液一般保持在酸性环境,经脱色处理的发酵上清液pH为5.86,可以直接用来上柱。
表1 pH对D001树脂交换容量的影响
2.3 D001树脂对GABA的吸附等温线及吸附动力学曲线
吸附等温线是指在一定温度下溶质分子在两相界面上进行的吸附过程达到平衡时它们在两相中浓度之间的关系曲线。在室温条件下,D001阳离子交换树脂的吸附等温线如图2所示。随着GABA的浓度升高,D001树脂的交换容量增大,当质量浓度大于5 g/L后,继续增加GABA浓度对树脂的交换容量影响不大。
相对于凝胶型树脂,大孔树脂具有表面积大,交换速度快等特点,因此大孔树脂的利用率更高。在静态试验中,分别测定各时间点的树脂交换容量,图2显示D001树脂很快对GABA进行吸附作用,并在60 min时离子交换量达到最大值,交换容量达160 mg/g。因此选择大孔型强酸性阳离子交换树脂D001作为GABA的分离介质是合适的。
图2 D001树脂对GABA的吸附等温线及吸附动力学曲线
2.4 上样流速对吸附的影响
上样液选择的流速是离子交换过程中的一个重要参数,为了使物质发生有效的交换,必须使固液两相有充分的接触时间。流速过快容易造成交换区拉长,提前发生渗漏。流速过慢则降低交换效率。如图3所示,分别以0.5、1、2 BV/h的流速上样。当流速为2 BV/h时,穿透点出现较早,树脂提前发生渗漏,造成GABA流失。流速下降则穿透点延迟,树脂利用率高。流速降为0.5 BV/h穿透点变化不大,且鉴于低流速导致上柱时间延长,适宜的上样流速选择为1 BV/h。
2.5 洗脱液浓度对解吸的影响
氨基酸离子交换的常用洗脱剂有氨水、铵盐溶液和NaOH溶液等,由于氨水具有挥发性容易除去且不易带入杂质,所以选择氨水作为洗脱剂。上样过程中,部分前体物质谷氨酸通过竞争作用被树脂吸附,直接用氨水洗脱无法保证两种物质的分离效果。由于谷氨酸是酸性氨基酸,因此可以在氨水洗脱前以大量去离子水对树脂进行水洗处理,处于解离状态的谷氨酸易被去离子水洗去。
分别以1、2 mol/L的氨水作为洗脱剂,1 BV/h的流速对饱和树脂柱进行洗脱,测定各取样点的GABA含量。以1 mol/L氨水为洗脱剂时,GABA峰形较宽,峰值不集中,洗脱剂使用量大;而使用浓度更高的氨水,由于离子强度大置换速度快,峰值较为集中,洗脱周期短,因此应选择2 mol/L的氨水作为洗脱剂。
2.6 洗脱液收集、浓缩与结晶
一般的结晶方法有冷却结晶、蒸发结晶及反应结晶3种工艺[12]。另外,氨基酸结晶工业中常向氨基酸水溶液中加入适量有机溶剂来降低其饱和浓度达到结晶的目的[13]。收集洗脱液后经旋转蒸发仪于60℃下真空浓缩得GABA固形物,少量去离子水复溶后立即加入8倍体积无水乙醇,将温度降至室温后再于4℃冰箱静置12 h后,过滤收集晶体。如图5所示GABA结明晶为透针状,GABA的总收率为45.4%。
图5 GABA的针状结晶
通过离子交换法分离纯化红曲霉发酵液中GABA,比较3种脱色剂的脱色效果及GABA损失率选择D101大孔树脂作为红曲发酵液的脱色剂。30%的D101添加量脱色率达到90%以上,且GABA损失率仅5%左右。
在静态试验下,考察了上样液的最佳上样pH及D001对GABA的等温吸附线及吸附动力学。结果显示D001树脂与GABA交换速度快,效率高,经过脱色的发酵液pH适宜直接上柱。
在动态条件下,选择1 BV/h的上样流速,氨水洗脱前用去离子水水洗除去谷氨酸,洗脱液氨水的浓度为2 mol/L,收集发酵液浓缩后结晶可得透明针状结晶,GABA的总得率为45.4%。
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Study on Separation of γ-Aminobutyric Acid from Monascus Fermentation Broth by D001 Ion-exchange Resins
Ji Hao Jiang Donghua Zhou Qin Wang Pengrong Dong Xiameng Cai Qimin
(College of Chemistry and Life Sciences,Zhejiang Normal University,Jinhua 321004)
The separation process of γ-Aminobutyric acid(GABA)from monascus fermentation broth was researched.Three types of decolorants were selected,and the D101 exhibited high decoloring ratio and high GABA yield.The static and dynamic adsorption-desorption performances were investigated to obtain optimized conditions of GABA separation by D001 ion - exchange resins.The result showed that the optimum parameters were as follows:original pH of decolor fermentation broth,sample flow - rate of 1 BV/h,elution method of two steps by using water and 2 mol/L aqueous ammonia.The transparence needle crystal of GABA was obtained after the effluent concentrated.The total recovery rate was 45.4%.
γ -Aminobutyric acid,monascus fermentation broth,D001 ion-exchange resins,separation
Q819
A
1003-0174(2011)08-0095-05
国家自然科学基金(31070008),浙江省自然科学基金(Y3090343)
2010-11-02
嵇豪,男,1986年出生,硕士,应用微生物学
蒋冬花,女,1964年出生,教授,微生物学和植物病理学