运动、IGF－I诱导骨骼肌适应性肥大的机理研究

朱 晗，赵 华，曾凡星

(1．北京体育大学运动人体科学学院，北京 100084;2．天水师范学院体育学院，甘肃天水 741001)

运动、IGF－I诱导骨骼肌适应性肥大的机理研究

朱 晗1，赵 华2，曾凡星1

(1．北京体育大学运动人体科学学院，北京 100084;2．天水师范学院体育学院，甘肃天水 741001)

目的:采用注射外源性IGF－I和一周跑台运动，观察对大鼠骨骼肌mTOR信号通路的影响，深入探讨IGF－I对运动骨骼肌适应性肥大的机理。方法:8周龄雄性SD大鼠在适应性训练后分为四组:安静组(S)、安静IGF－I组(SI)、运动组(E)、运动+IGF－I组(EI)。运动方式为跑台运动(20m/min，10%，60min/d)，每天一次，共7天。外源性IGF－I为小腿后侧肌肉隆起处的皮下注射。用Western Blotting法检测腓肠肌MHC、PI3K、AKt、mTOR、p70S6K蛋白和Akt(Ser473)、mTOR(Ser2448)和p70S6K(Thr389)的磷酸化表达。结果:在一周后，外源性IGF－I显著促进骨骼肌MHC的表达，骨骼肌PI3K、Akt、mTOR蛋白和Akt(Ser473)、mTOR(Ser2448)和p70S6K(Thr389)的磷酸化表达显著增强。运动显著促进mTOR蛋白和Akt(Ser473)、mTOR(Ser2448)和p70S6K(Thr389)磷酸化的表达。对运动的反应，上述信号的磷酸化表达高于蛋白表达。结论:1)一周外源性IGF－I注射明显促进运动骨骼肌mTOR通路的活性;而1周跑台运动与IGF－I具有协同增强效应。2)在运动和注射外源性IGF－I的刺激下，mTOR通路各信号分子的磷酸化表达比蛋白表达更为敏感。建议今后对信号的研究以检测信号分子的磷酸化表达为主。

IGF－I;mTOR通路;骨骼肌肥大;运动

研究证实，磷脂酰肌醇－3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号是骨骼肌蛋白质合成的最主要信号转导通路［1］，近年已成为骨骼肌生理学的研究热点之一。目前在体运动的情况下，利用增强骨骼肌中IGF－I来对肌肉内mTOR通路整个上下游信号进行的研究尚不多见，本文应用注射外源性IGF－I结合运动深入观察mTOR信号通路变化特点，希望能较深入阐明IGF－I诱导骨骼肌肥大的机理。

1 材料与方法

1.1 研究对象与分组

健康雄性、SPF级8周龄SD大鼠，体重(177.8±5.4)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。国家标准啮齿类动物饲料，分笼饲养，4只/笼。自由饮食，温度维持在22℃～24℃，相对湿度50%～65%。昼夜节律人工控制光照(光照时间为8:00－20:00)。大鼠经适应性训练后，随机分为四组:安静组(S)、安静IGF－I注射组(SI)、1周跑台运动组(E)、运动+IGF－I注射组(EI)，每组6只。实验前各组体重无显著差异。

1.2 动物运动方案

正式运动训练前，大鼠在跑台上进行4天的适应性训练，然后休息3天。适应性训练方案见表1。

表1 动物适应性训练方案

正式实验研究共7天，安静组给予常规饲养，运动组大鼠进行7天运动，运动方案为上坡跑(坡度为10%)、速度20m/min，每天训练60min。(根据Bedford经验公式，相当于75%VO2max)［2］。

1.3 IGF－I注射方案

在大鼠小腿后面肌腹隆起处进行皮下注射IGF－I。每次运动后即刻，安静注射组和运动注射组在大鼠小腿后肌腹隆起处的皮下注射IGF－I。安静和运动组分别注射同等剂量的生理盐水。具体剂量安排如表2。

表2 IGF－I注射剂量安排表

1.4 测试样本采集与处理

取材前禁水禁食12h，以0.3ml/100g为剂量，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。麻醉后速取后肢腓肠肌。剔除肌腱及筋膜组织，用干净滤纸将其吸干，用锡纸将其包裹后迅速投入液氮，于－80℃冰箱保存待测。

1.5 指标测试方法

蛋白浓度测试(Bradford)配制Bradford工作液:按照《精编分子生物学实验指南》配制［3］。采用Western Blot方法分别测试MHC、PI3K、Akt、mTOR、p70S6K蛋白和Akt(Ser473)、mTOR(Ser2448)、p70S6K(Thr389)磷酸化表达。

Tris－甘氨酸电泳缓冲液、上样缓冲液、电转液、堆积胶和分离胶的配制均参照《Current protocols in protein science》实验方法［4］，TBS、TBST、封闭液按照Cell Signaling抗体说明书的要求配制。

取100μg总蛋白配制成上样体系，置95℃沸水中5min，再于4℃中冷却，上样前以3000rpm离心5min。配制分离胶6%(MHC、mTOR)、8%(PI3K、p70S6K)和10%(Akt、β－actin)，以及5%浓缩胶。浓缩胶用80V恒压，分离胶换120V恒压电泳。再用半干转将蛋白转到NC膜上，以恒压20V半干转。封闭90min后用加入一抗，不同抗体稀释比例分别为β－actin(购自Santa Cruz公司)为1∶500，Fast Myosin Skeletal Heavy chain antibody［MY－32］(Abcam公司)为1∶2000，PI3K抗体(Cell Signaling公司)为1∶1200，Akt抗体(Cell Signaling公司)为1∶1500，Phospho－Akt(Ser473)(Cell Signaling公司)为1∶800，mTOR(Cell Signaling公司)为1∶1000，Phospho－mTOR(Ser2448)(Cell Signaling公司)为1∶800，p70S6K抗体(购自Cell Signaling公司)为1∶1000，Phosphop70S6K(Thr389)(Cell Signaling公司)为1∶1200，然后4℃孵育过夜。次日晨在用TBST洗膜后用不同浓度二抗室温孵育60min。用ECL发光试剂与膜在暗室中反应、曝光。曝光底片用凝胶成像系统的透光进行拍照，用Quantity One图像分析系统分析。将每个条带与相应样品的β－actin条带光密度值进行比较，计算出目的条带的相对含量值。

1.6 数理统计法

运用SPSS 13.0软件对实验检测结果进行实验数据处理。组间比较采用双因素方差分析(UNIANOVA)和单因素方差分析(One－Way ANOVA)。对实验观测点的组间多重比较(Post Hoc)采用LSD或Tamhane’s T2方法分析。P＜0.05表示具有显著性差异，P＜0.01表示具有非常显著性差异。

2 结果

图1和表3显示:1周外源性IGF－I注射显著促进了骨骼肌MHC表达(F=18.455，P＜0.01)，1周跑台运动具有促进的趋势(F=0.627，P＞0.05)。外源性IGF－I显著促进骨骼肌 PI3K蛋白(F=10.679，P＜0.01)、Akt蛋白(F= 31.837，P＜0.01)、mTOR蛋白(F=20.114，P＜0.01)和Akt (Ser473)(F=6.978，P＜0.05)、mTOR(Ser 2448)(F= 11.307，P＜0.01)和p70S6K(Thr 389)(F=19.696，P＜0.01)的磷酸化表达。运动显著促进mTOR蛋白(F=5.433，P＜0.05)和 Akt(Ser473)(F=19.092，P＜0.01)、mTOR (Ser2448)(F=23.942，P＜0.01)和 p70S6K(Thr 389)(F= 32.541，P＜0.01)磷酸化的表达。

图1 IGF－I和运动干预下MHC和mTOR信号通路表达图

表3 IGF－I和运动干预下大鼠腓肠肌MHC和mTOR通路表达值(相对含量)

实验发现，IGF－I和运动因素间存在相互协同增强效应。具体表现为安静IGF－I注射组(SI)和运动+IGF－I注射组(EI)的MHC均显著高于安静组(S)和运动组(E)(分别为18%和15.7%、23%和20.6%)。SI和EI组的PI3K均显著高于安静组(分别为11%和14%)，运动+IGF－I注射组显著高于运动组(10.7%)。SI组和EI组的Akt均显著高于S组和E组(分别为17%和15%、28%和25%)。E组和EI组的Akt(Ser473)磷酸化显著高于S组(27%和43%)，EI组显著高于SI组(22.2%)。SI组和EI组的mTOR均显著高于S组(分别为18%和26%)。EI组的mTOR(Ser 2448)磷酸化显著高于S组、SI组和E组(分别为35%、27.4%和19.5%)。EI组的p70S6K(Thr 389)磷酸化显著高于S组、SI组和E组(分别为48%、27.6%和21.3%)，SI组和E组显著高于S组(16%和22%)。对运动的反应:Akt蛋白和Akt (Ser473)均值分别为 1.02，1.27;mTOR蛋白和 mTOR (Ser2448)均值分别为 1.09，1.13;p70S6K蛋白和 p70S6K(Thr389)均值分别为1.06，1.22。上述指标的磷酸化表达均高于其蛋白表达。

3 讨论

多年来，对IGF－I的作用已经开展了广泛的研究，均发现IGF－I在肌肉蛋白质合成中发挥了十分重要的作用，但IGF－I诱导蛋白质合成的信号转导机制尚不清楚。以往的研究曾认为，IGF－I可能通过钙调信号起作用。Musaro等［5］对大鼠肌细胞进行L6MLC/IGF－1的培养，然后进行calcineurin质粒转染，之后用钙离子载体和环孢素A进行药物干预。研究发现IGF－I能增强骨骼肌内钙调信号通路，并激活GATA－2和NF－AT，从而促进骨骼肌肥大。而后续的众多研究显示，IGF－I只是与钙离子通道发生协同效应，在IGF－I促进骨骼肌肥大的过程中，钙调信号通路并非居于主导地位。Rommel等［6］用C2C12肌细胞培养，用IGF－I (10ng/ml)、A23187(0.1－10 μM)、LY294002(10μM)、雷帕霉素(20ng/ml)、CsA(5μM)、PD98059等药物以激活或阻断IGF－I相关的信号通路，发现在IGF－I促进骨骼肌肥大的过程中，IGF－I促进肌肉肥大主要是通过Akt所介导的信号通路来完成，并且是通过 Akt介导的 PI3K/Akt/mTOR和PI3K/Akt/GSK3通路发挥作用。

实验研究发现，一周外源性IGF－I注射显著促进骨骼肌MHC表达，而1周跑台运动有促进其表达的趋势。外源性IGF－I显著促进骨骼肌PI3K蛋白、Akt蛋白、mTOR蛋白和Akt(Ser473)、mTOR(Ser 2448)和p70S6K(Thr 389)磷酸化表达。运动显著促进mTOR蛋白和Akt(Ser473)、mTOR(Ser 2448)和p70S6K(Thr 389)(P＜0.01)磷酸化的表达。外源性IGF－I和运动因素间存在协同增强效应。同时本研究还发现，在运动和注射外源性IGF－I的刺激下，各信号分子的磷酸化状态比蛋白表达表现得更为敏感。

PI3K是细胞的重要信号蛋白，在许多细胞的生存、增殖、分化、代谢过程中起着非常重要的作用［7］，并且与膜泡转运、细胞骨架重组、细胞存活、肿瘤发生、抗凋亡等病理生理过程密切相关［8］，同时也是IGF－I介导肌肉蛋白质合成信号转到途径中的关键环节。IGF－I在对卫星细胞池进行调节的过程中，能利用多种信号通道，如钙调磷酸酶/NFAT、促分裂蛋白激酶、磷脂酰肌醇3－激酶(PI3K)等。Coolican等人认为IGF－I激活卫星细胞产生分化是经PI3K通道的介导［9］。本研究发现，外源性的IGF－I能够刺激PI3K蛋白表达量显著性增加(增加约11%)，这与其他学者的研究趋于一致。目前的研究认为，生长因子等细胞外信号刺激激活PI3K主要通过两种途径:一是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用，引起二聚体构象改变而激活;二是通过Ras蛋白和p110直接结合使其激活［10］。

Akt是PI3K的下游信号，其激活后可以通过下游的一系列底物促进细胞的生长、增殖等［11］。目前的研究发现IGFI可以诱导Akt磷酸化表达水平增加，并在IGF－I介导的骨骼肌纤维肥大中发挥了重要作用［6，12］。Lai等［13］通过基因转染使成体骨骼肌持续表达有活性的Akt，2－3周后骨骼肌体积明显增大，平均骨骼肌纤维横断面积增加超过两倍，说明IGF－I下游信号Akt的激活足以引起肌肉肥大。本研究发现，对大鼠外源性注射IGF－I可以使Akt蛋白和磷酸化均增加约17%，提示IGF－I通过PI3K信号通路对Akt产生了激活效应。其具体途径可能为:IGF－I与其受体结合活化PI3K，激活的PI3K磷酸化质膜上PIP2，产生第二信使PIP3，PIP3与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt和PDK1结合，促使PDK1磷酸化Akt蛋白上Ser308位点，导致Akt的活化。Akt活化后，可抑制TSC1－TSC2，后者有抑制mTOR的功能，mTOR能促进蛋白质合成，Akt活化后抑制TSC1－TSC2，使后者对mTOR的抑制作用减弱，最终导致mTOR促进蛋白合成能力增加［14］。

mTOR对于骨骼肌的分化具有重要作用［15，16］。学者们已经通过使用雷帕霉素阻断mTOR信号的方法对mTOR的生物学效应进行了广泛的研究，发现阻断mTOR信号可以阻断运动诱导的I型和II型肌纤维肥大［1］。用雷帕霉素阻断mTOR后，可以阻断骨骼肌肥大效应的95%。研究发现，活化的Akt可以作用于mTOR的Ser2448位点，引起Ser2448位点的磷酸化。这一位点的磷酸化被认为是mTOR活性的标志，可以继而引起其下游信号表达的增加［17］。本研究发现，IGF－I在促进Akt磷酸化水平显著性提高的同时，使mTOR蛋白表达和mTOR(Ser2448)磷酸化分别增加18%和6%。

mTOR的促合成效应主要是通过对p70S6K和4EBP1活化后来实现的。p70S6K和4EBP1是mRNA翻译的关键调控子，它们是mTOR的最具特征性的靶分子，其中p70S6K被认为是骨骼肌蛋白合成的重要生物标志物之一。本研究发现，一周注射外源性的IGF－I能够刺激p70S6K(Thr389)蛋白磷酸化水平显著性增加约16%，但p70S6K蛋白表达未见显著变化。

本实验发现，运动对mTOR信号通路的影响主要偏重于Akt和mTOR活性的影响。运动可能主要通过Akt来影响mTOR信号，从而影响骨骼肌内的蛋白合成过程。本研究发现，在对大鼠进行了1周75%VO2max的跑台训练后，于运动后6小时取材。与安静组相比，运动组大鼠PI3K蛋白表达量增加了3%，Akt(Ser473)磷酸化水平增加27%，mTOR (Ser2448)磷酸化水平增加13%;而局部注射外源性IGF－I对骨骼肌PI3K蛋白、Akt和mTOR的活性均有显著影响，显示出IGF－I对整个PI3K/Akt/mTOR通路均有显著的促进效应。而运动则可能主要通过Akt来影响mTOR信号，从而影响骨骼肌内的蛋白合成过程。

4 结论

1)一周外源性IGF－I注射明显促进运动骨骼肌mTOR通路的活性，且为整体性;而运动与IGF－I具有协同增强效应，且运动对该通路的影响有所侧重。

2)在运动和注射外源性IGF－I的刺激下，通路各信号分子的磷酸化状态比蛋白表达更为敏感。建议以检测信号分子的磷酸化表达为主。

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Mechanism of Exercise and IGF-I Inducing Skeletal Muscle Adaptive Hypertrophy in Rats

ZHU Han1，ZHAO Hua2，ZENG Fanxing1
(1．Sport Science College，Beijing Sport University，Beijing 100084，China;
2．Physical Education Department，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，Gansu，China)

Objective:the purpose of this study was to examine the effect of mTOR signal pathway on Skeletal Muscle A-daptive Hypertrophy in resistance treadmill exercise model through injecting exogenous IGF-I in vivo．Methods:adult male Sprague-Dawley rats(8 weeks old)were randomly divided into 4 groups after adaptive training:sedentary(S)，IGF-I group (SI)，exercise group(E)and IGF-I plus exercise group(EI)．The following treadmill training was applied:20m/min at 10%slope，60 min;once per day，7 days．Rats were treated daily with exogenous IGF-I(5．5 mg/kg，diluted with saline)or saline local subcutaneously for 7 days．The MHC，PI3K，AKt and phosphorylation of Akt(Ser473)，mammalian target of rapamycin(mTOR)and phosphorylation of mTOR(Ser2448)，p70S6Kand phosphorylation of p70S6K(Thr 389)of gastrocnemius muscle were determined by Western blotting．Results:After 1 week，wet weight and MHC of gastrocnemius muscle was promoted significantly by IGF-I，PI3K，AKt and phosphorylation of Akt(Ser473)，mTOR and phosphorylation of mTOR(Ser2448)，p70S6Kand phosphorylation of p70S6K(Thr 389)were significantly promoted by IGF-I，and but they were elevated by exercise except PI3K．Conclusions:These results suggest that:1)The mTOR pathway of skeletal muscle was significantly promoted by exogenous IGF-I，and the positive effect was global．Exercise had synergy effect with exogenous IGF-I in vivo，while exercise can synergy improve mTOR pathway with IGF-I．The effect of exercise was particular emphasis on partial elements of mTOR pathway．2)Phosphorylations of mTOR pathway were sensitive than total-molecules．

IGF-I;mTOR pathway;skeletal muscle hypertrophy;exercise

G804.21

A

1004－0560(2011)04－0074－04

2011-06-12;

2011-07-16

国家自然科学基金项目(批准号30671013)。

朱 晗(1980－)，女，助理研究员，主要研究方向为运动生理学。

曾凡星(1956－)，男，教授，博士生导师，主要研究方向为体育运动中内分泌变化及适应机制研究，E－Mail:fanxingz@china．com．cn。

责任编辑:乔艳春

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