油茶蒲提取物中次生代谢产物的测定

罗晓伟，沈建福，肖仁显，陈中海

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310029)

油茶蒲提取物中次生代谢产物的测定

罗晓伟，沈建福*，肖仁显，陈中海

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江杭州310029)

目的:建立准确测定油茶蒲提取物中总皂素、总酚、总黄酮的方法。测定醇提物及其三个分级相中三者的含量。方法:采用香草醛-冰醋酸-高氯酸法测定总皂素，Folin-Ciocalteau法测定总酚，硝酸铝法、氯化铝法、紫外直接测定法测定总黄酮。结果:油茶蒲50%醇提物中含27.35%皂素，22.41%多酚;正丁醇相中皂素含量最高，达44.05%;乙酸乙酯相中多酚含量最高，达35.34%。在黄酮含量测定中，硝酸铝法结果明显偏大，氯化铝法回收率偏大，确定紫外法为油茶蒲提取物中测定黄酮的有效方法。结论:确定的三种方法简便易行，准确可靠，精密度和回收率都较理想。油茶蒲提取物中含有大量的皂素、多酚和少量的黄酮，为进一步探索其生理活性奠定基础。

油茶蒲，皂素，多酚，黄酮

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

油茶果壳 品种为普通白花油茶，取自浙江省常山县芳村镇;人参皂素Re 上海融禾医科技术发展有限公司，纯度98%;焦性没食子酸 国药集团化学试剂有限公司;芦丁标准品 SIGMA，纯度95%;其余试剂 均为分析纯。

TU-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;RE-52AAA旋转蒸发器 上海嘉鹏科技有限公司;SHB-ⅢA循环水式多用真空泵 上海豫康科教仪器设备有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;BS124S万分之一天平 Sartorius公司。

1.2 实验方法

1.2.1 油茶果壳提取物及分级相的制备 油茶果壳经挑选后热风干燥，用50%的乙醇溶液，以料液比1∶5，超声辅助提取两次，喷雾干燥，即得到油茶蒲醇提物。

将油茶蒲醇提物的水溶液，依次用等体积的乙酸乙酯和正丁醇分别萃取3次，分别将得到的乙酸乙酯相，正丁醇相及水相旋转蒸发至干粉。

供试样品的制备:取一定量的油茶蒲醇提物、乙酸乙酯相、正丁醇相、水相物质定容至10mg/mL。

1.2.2 总皂素的定量测定［3］测定波长的选择:人参皂苷溶液和供试样品经香草醛-冰醋酸-高氯酸反应，400～800nm下扫描波长，在548nm处有最大吸收峰，因此选择548nm为测定波长。

标准曲线的制备:精密吸取1mg/mL的人参皂苷标准品溶液0、50、100、150、200、250μL，氮气吹干溶剂，分别加入5%香草醛-冰醋酸0.2mL，高氯酸0.8mL，摇匀，60℃水浴15min，取出放置冰水中冷却，加入5mL冰乙酸稀释，在548nm波长处测定吸光值，同时以试剂空白做参照。以人参皂苷的含量(μg)为横坐标，A548为纵坐标，做回归方程。

精密度测定:精密吸取5份同一标准品，按测定方法处理并显色，计算相对偏差RSD值。

回收率测定:精密吸取已知总皂素的供试样品5份，加入一定量标准品，按测定方法处理并显色，计算回收率，RSD值。

稳定性测定:按样品测定方法操作，每5min测定供试液的吸光值，观察其在45min内的变化情况，计算10个结果的RSD值。

样品测定:精密吸取一定量的供试样品溶液于10mL具塞试管中，按标准曲线的方法显色，做3次平行，测定吸光值，计算含量。

1.2.3 总酚的定量测定［4］测定波长的选择:没食子酸标准溶液和供试样品经Folin-Ciocalteau法反应，400～800nm下扫描波长，在760nm处有最大吸收峰，因此选择760nm为测定波长。

标准曲线的制备:精密吸取0.1mg/mL的没食子酸标准溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL于10mL容量瓶中，加入1.0mL Folin-Ciocalteu试剂，加入2mL 15%Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至10mL，充分混合后，室温放置2h，于760nm波长下测定吸光度A760，以没食子酸含量(μg)为横坐标，A760为纵坐标，绘制标准曲线。

精密度、回收率、稳定性、样品测定参照1.2.2。

1.2.4 总黄酮的定量测定

1.2.4.1 亚硝酸钠-硝酸铝显色法［5］测定波长的选择:芦丁标准溶液和供试样品经亚硝酸钠-硝酸铝显色，400～800nm下扫描波长，在510nm处有最大吸收峰，因此选择510nm为测定波长。

标准曲线的制备:精确吸取1.0mg/mL芦丁储备液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL于10mL具塞比色管中，每管用50%乙醇补至5mL，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.5mL，摇匀后放置6min，加入10%硝酸铝0.5mL，摇匀，放置 6min，加入 5%氢氧化钠溶液2.5mL，混匀，用50%乙醇定容至10mL，静置15min，于510nm处测定吸光度。以芦丁含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

精密度、回收率、稳定性、样品测定参照1.2.2。

1.2.4.2 氯化铝-醋酸缓冲体系显色法［6］测定波长选择:芦丁标准溶液和供试样品经氯化铝-醋酸体系显色，400～800nm下扫描波长，在410nm处有最大吸收峰，因此选择410nm为测定波长。

标准曲线的制备:精确吸取1.0mg/mL芦丁储备液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL于10mL具塞比色管中，每管用50%乙醇补至1mL，加入1.5%AlCl33.2mL和pH5.5的NaAC-HAC缓冲液2mL，并用50%乙醇定容至刻度，摇匀，静置30min，于410nm处测定吸光值。以芦丁含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

精密度、回收率、稳定性、样品测定参照1.2.2。

1.2.4.3 紫外直接测定法［5］测定波长的选择:芦丁标准溶液和供试样品经紫外扫描，在360nm处有最大吸收峰，因此选择360nm为测定波长。

标准曲线的制备:精密吸取芦丁储备液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6mL于10mL具塞比色管中，用50%乙醇定容至 10mL，充分混匀，静置 5min，于360nm处测定吸光值，以芦丁含量(μg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

精密度、回收率、稳定性、样品测定参照1.2.2。

2 结果与分析

2.1 油茶蒲粗提物各分级相的得率

油茶果壳粗提物经乙酸乙酯、正丁醇萃取，剩余水相，各萃取相的得率如图 1所示，乙酸乙酯22.15%，正丁醇33.02%，水相44.83%。

图1 油茶果壳提取物的三相萃取得率

2.2 化学成分测定方法比较

用香草醛-冰醋酸-高氯酸测定油茶果壳提取物中总皂素，Folin-Ciocalteau法测定总酚，亚硝酸钠-硝酸铝法、氯化铝法、紫外直接测定法测定总黄酮的结果如表1所示，香草醛-冰醋酸-高氯酸测定油茶果壳提取物中总皂素，Folin-Ciocalteau法测定总酚，亚硝酸钠-硝酸铝法、氯化铝法、紫外直接测定法测定总黄酮的相关系数(R2)高，相对标准偏差(RSD)小，回收率好，并且在45min内稳定性高，是可行的检测方法。用氯化铝-醋酸缓冲体系测定油茶果壳提取物中的黄酮回收率偏高。

2.3 化学成分的测定结果

油茶蒲醇提物经萃取之后，油茶皂素的含量主要集中在乙酸乙酯相和正丁醇相，分别达到43.69%和44.05%;总酚为乙酸乙酯相最高，达到35.34%。总黄酮含量的比较中，亚硝酸钠-硝酸铝法测定的结果明显比氯化铝法、紫外法测定的结果大(见表2)。

表1 测定方法的各指标比较

表2 油茶果壳提取物中化学成分分析

3 讨论

皂素的测定方法有沉淀法、分光光度法、溶血指数法、色谱法等，其中分光光度法操作简便、灵敏，是经典成熟的测定方法。孙冀平［4］在测定茶籽饼粕中的皂素含量时比较了香草醛-冰醋酸-高氯酸、香草醛-冰醋酸-浓硫酸，香草醛-浓硫酸-乙醇，香草醛-高氯酸-乙醇4种方法，发现香草醛-冰醋酸-高氯酸法稳定，抗糖、蛋白干扰力强，可信度好。Folin-Ciocalteau比色法用于测定油茶果壳提取物中多酚操作简便，精密度高，稳定性好，有很好的回收率。

以芦丁为标准品，文中比较了硝酸铝法、氯化铝法、紫外测定法，结果表明硝酸铝法测定结果明显偏高，油茶果壳粗提物中黄酮含量分别约为氯化铝法和紫外测定法的29倍和13倍。原因分析如下:a.硝酸铝法不是黄酮类化合物的专属反应，凡具有邻苯二羟基的物质，均能用此法进行显色测量;b.前期实验室研究表明油茶果壳提取物中含有没食子酸、鞣花酸等多酚类物质均具有邻苯二羟基的结构。所以硝酸铝法不适用于油茶果壳提取物中黄酮的检测。何书美等［6］提出氯化铝法具有较强的抗多酚和鞣质干扰能力，但实验结果表明该方法回收率明显偏大，所以选择紫外直接测定法用于测定油茶果壳提取物中的黄酮含量。实验测得油茶果壳粗提物中黄酮含量为2.81%±0.11%，乙酸乙酯相、正丁醇相和水相分别为3.35%±0.05%、2.34%±0.07%和0.98%±0.05%。

前期研究发现，油茶蒲醇提物具有强抗氧化性，抗肿瘤能力［2］。现对其次生代谢产物进行分析，发现油茶蒲提取物中含有大量的皂素、多酚和少量的黄酮。这为进一步探索油茶蒲的生物活性奠定基础。

4 总结

油茶蒲提取物中采用香草醛-冰醋酸-高氯酸法测定总皂素，Folin-Ciocalteau法测定总酚，紫外直接测定法测定总黄酮简便易行，结果准确可靠，精密度高，回收率好，是可行的检测方法。油茶蒲醇提物中含有大量的皂素、多酚和少量的黄酮，为进一步研究其生理活性奠定基础。

［1］马力.油茶籽的综合开发利用［J］.中国食品添加剂，2007 (3):126-129.

［2］陈亚琪.油茶蒲提取物抗氧化及抗癌活性研究［D］.浙江:浙江大学，2010.

［3］孙冀平.茶叶籽中皂素及多糖的研究［D］.江苏:江南大学，2003.

［4］Matteo Bonoli，Vito Verardo，Emanuele Marconi，et al. Antioxidant phenols in barley(Hordeum vulgare L.)flour: comparative spectrophotometric study among extraction methods of free and bound phenolic compounds［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004，52:5195-5200.

［5］王勇，赵海燕，封琳，等.几种甘草黄酮含量测定方法的比较与评价［J］.安徽农业科学，2009，37(28):13593-13595.

［6］何书美，刘敬兰.茶叶中总黄酮含量测定方法的研究［J］.分析化学研究简报，2007，35(9):1365-1368.

Determination of secondary metabolism in extracts from fruit shell of Camellia oleifera Abel.

LUO Xiao-wei，SHEN Jian-fu*，XIAO Ren-xian，CHEN Zhong-hai
(College of Biosystems Engineering and Food Science，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China)

Objective:Establish accurate method and detect contents of total saponin，flavonoids and polyphenol in extract from shell of Camellia oleifera Abel and its three fractions.Method:Use vanillin-acetic acid-perchloric acid to detect total saponin，Folin-Ciocalteau to detect total polyphenol，Al(NO3)3，AlCl3and ultraviolet method to detect flavonoids.Results:The contents of total saponin and total polyphenol were respectively 27.35%，22.41%in alcohol extract.Maximum amount of saponin was found in butanol fraction，44.05%.The content of polyphenol was 35.34%， highest in ethyl acetate fraction.In flavonoids’detections，Al(NO3)3method produced higher results，AlCl3method produced higher recovery rate，therefore，ultraviolet determination was practical.Conclusion:Methods are convenient and reliable in determining three components，and the precision and recovery rate are fairly well. Extracts contain large amounts of saponin，polyphenols and a small amount of flavonoids.The results build the basis of further physiological research.

shell of Camellia oleifera Abel.;saponin;polyphenol;flavonoids

TS207.3

A

1002-0306(2011)11-0451-03

油茶(Camellia oleifera Abel.)是我国特有的木本油料树种，目前全国种植面积约为400万hm2，主要分布在湖南、江西、广西、浙江、福建、安徽和贵州等地。我国对油茶的利用主要集中在将油茶籽进行榨油，油茶籽粕提取皂素。占油茶果总重量近60%的油茶蒲基本上被废弃或焚烧处理，造成很大的资源浪费和环境污染。前期报道指出，油茶蒲含有大量木质素、多缩戊糖、蛋白质和皂素等化学成分，可以用来生产栲胶、糠醛、木糖醇、活性炭等［1］;其提取物具有很强的抗氧化、抗肿瘤功能［2］。但对其中的次生代谢产物如皂素、多酚、黄酮的含量及测定方法还未具体报道。本研究采用紫外-可见分光光度法，分别以人参皂苷、没食子酸、芦丁为对照品，建立了准确、快速、稳定，适用于油茶蒲提取物中总皂素、总酚、总黄酮的测定方法。

2010-09-14 *通讯联系人

罗晓伟(1987-)，女，硕士研究生，研究方向:油茶副产物的加工利用。

国家自然科学基金(30872056)。