3，5-二硝基水杨酸法测定不同高度麦苗中淀粉酶的活性强度*

刘志洋 周心怡 赵景荣 葛安琪 杨志孝

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

研究[1－3]发现，小麦嫩叶富含麦绿素、天然维生素、矿物质及多种氨基酸和酶，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗炎、抗肥胖和抗癌等功效，是一种安全优良的天然食品。我国小麦产量和面积仅次于水稻，居第二，北方又是小麦的主产区，且以冬季小麦为主，冬小麦在入冬以前和初春所发生的分孽多为无效分孽，因此可利用麦叶资源十分丰富。淀粉酶是催化淀粉水解的一类酶，普遍存在于动植物体内。几乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌发的禾谷类种子，淀粉酶活性最强，主要是α淀粉酶和β淀粉酶。种子萌发时，淀粉酶活性随萌发时间迅速增加，将淀粉分解成小分子糖类，供幼苗生长[4－5]，本实验采用3，5-二硝基水杨酸法[6]测定麦苗在不同的生长高度时淀粉酶活性的变化情况，旨在进一步探索开发小麦这一优质食物资源，为生产实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

小麦种(购于市场)，体式蒸汽消毒器(YXQ02型电热式，山东新华医疗厂)，净化工作台(YJ-875B，苏州中亚净化设备有限公司)，真空干燥箱(DZF-6210，上海精宏制造厂)，光照培养箱(GZX-400BS-Ⅲ，上海新苗医疗器械制备有限公司)，超声提取器，电子分析天平(0.1 mg，上海)，S54-紫外分光光度计(上海棱光仪器公司)，加样器(德国产)，高速冷冻离心机(SIGma K30)，3，5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钠、柠檬酸钠、硫酸锌均为分析纯，实验用水均为亚沸蒸馏水，Φ=12 cm的培养皿。

1.2 方法

1.2.1 麦苗的培植

首先选取12只培养皿，分为两组，分别编号A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12;分别称取大小均匀、籽粒饱满的小麦20 g于培养皿中，加水没过小麦浸泡4 h后分别覆盖1.5 cm厚度的细沙放置于光照培养箱中，以温度为25℃条件下恒温培养。在培养过程中用自来水喷洒保持湿润;待A1～A12小麦的嫩苗分别生长高度为1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12 cm 时剪取收集备用。

1.2.2 试剂的配制

1%淀粉溶液:称取分析纯可溶性淀粉1.00 g，溶于适量的沸水中，冷却后定容至100 ml。

0.1 mol/L pH 5.6的柠檬酸缓冲液:A 液:称取柠檬酸20.00 g，溶解后稀释至1000 ml;B液:称取柠檬酸钠29.41 g，溶解后稀释至1000 ml。取A液55 ml与B液145 ml混匀，即为pH 5.6的缓冲液。

3，5 -二硝基水杨酸溶液:称取3，5-二硝基水杨酸1.0 g溶于20 ml 2 mol/L氢氧化钠溶液中，加入50 ml蒸馏水，再加入30 g酒石酸钠溶解后，用蒸馏水稀释至100 ml，盖紧瓶塞密封，勿使二氧化碳进入。

麦芽糖标准液:称取麦芽糖0.1000 g溶于少量蒸馏水中，转移至100 ml容量瓶中，用蒸馏水定容，标准浓度为 1.0 mg/ml。

1.2.3 麦芽糖标准曲线制作

取已校正洁净具塞刻度试管7只，编号后分别加入麦芽糖标准溶液 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml配制标准系列溶液，分别加入3，5-二硝基水杨酸1.0 ml摇匀，置于沸水浴中煮沸5 min，取出用流水冷却后，加蒸馏水定容至10 ml，标准系列溶液浓度分别为 0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0 μg/ml。用6号管标准溶液，在400～700 nm波长范围进行波长扫描，其最大吸收波长λmax=510 nm。以1号管作为空白调零点，以510 nm波长分别测定标准系列溶液的吸光度。由计算机自动以麦芽糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。曲线方程:Cone=94.001×Abs±0.053;相关系数 r=0.9998。

1.2.4 酶的活性测定

取洁净的100 ml容量瓶12只，分别称取A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9、A10、A11、A12 不同高度的麦苗各5 g分别置于研钵中，加蒸馏水12 ml和少量石英砂充分研磨。匀浆转入离心管中。以5000 r/min转速离心15 min，将上清液转移至50 ml容量瓶中，同法进行第2次处理，最后用亚沸蒸馏水定容至50 ml，即得麦苗淀粉酶待测液，麦苗浓度均为 0.1 g/ml。

准备12支洁净的20 ml的刻度试管分别编号1～12号，分别移取A1～A12麦苗待测液各0.20 ml于对应的试管中，水浴加热至40℃再加入已预热至40℃ 的1%淀粉溶液1.0 ml，在40℃水浴中恒温进行酶解15 min后，分别加入3，5-二硝基水杨酸2.0 ml摇匀，置于水浴中煮沸5 min，使3，5-二硝基水杨酸与淀粉被酶解后生成的还原糖充分发生反应，然后取出用流水冷却，加蒸馏水定容至20.0 ml，摇匀，用7号管麦苗溶液进行最大吸收波长扫描，最大吸收波长λmax=510 nm(图1)，同法配制空白溶液1份。用1 cm的比色皿，以波长510 nm为测定波长，以空白溶液调零后，分别测定1～12号溶液，由计算机直接读出测定溶液的浓度，通过计算可得到相应麦苗的还原糖的含量，由此表示酶活性强度[淀粉酶的活性强度计算公式(mg/g):Cx(μg/ml)×20 ml÷1000 ÷0.2 ml×0.1 g/ml]。

2 结果

2.1 麦芽糖标准溶液与麦苗待测液的吸收图谱

用3，5-二硝基水杨酸显色后，麦芽糖标准溶液和酶解淀粉溶液(麦苗淀粉溶液)，在400～700 nm波长范围内吸收图谱(图1)。

图1 标准溶液与麦芽溶液吸收图谱

2.2 麦芽糖标准工作曲线(图2)

图2 麦芽糖标准工作曲线

2.3 麦苗在不同生长高度时淀粉酶的活性情况 (表1)

表1 不同高度麦苗中淀粉酶的活性情况

3 讨论

本实验采用的是3，5-二硝基水杨酸法。麦苗提取液中的淀粉酶在40℃的水浴中将淀粉水解生成麦芽糖，麦芽糖与3，5-二硝基水杨酸发生反应，生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定范围内其颜色的深浅与还原糖糖浓度成正比，故可求出麦芽糖含量。从在400～700 nm范围吸收图谱分析，标准麦芽糖溶液与酶解溶液的吸收曲线的形态非常一致，最大吸收波长均为510 nm，从标准工作曲线的相关系数可知，r=0.9998，说明在 0 ～100 μg/ml浓度范围内具有良好的线性关系，因此，保证了测定数据的准确性。

实验结果表明麦苗在不同生长高度时其淀粉酶的活性强度不同;麦苗中淀粉酶的活性强度随生长高度的增加而减小。因此，合理控制小麦苗的生长高度，尽可能保持其淀粉酶活性强度，最大程度的发挥麦苗健胃消食、助消化的功效作用。麦苗是优质的天然食物，安全可靠，并且具有重要的营养保健作用[7－9]。人们在食用这一天然食物的同时，使身心获得健康，从而提高人们的健康水平和生活质量。

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