二氮嗪后处理联合预处理对心肌缺血再灌注损伤作用的研究*

鹿 欣 陈克彪 马 磊 张志东 夏 涛(泰山医学院附属泰山医院心脏血管外科，山东泰安 271000)

缺血预适应对缺血心肌可发挥强大的内源性保护作用[1]，但却没有能够在临床上得到应用。后处理的出现代表了新的有潜力的保护策略，同预处理比较可能有更广范围和更安全的临床应用价值[2]。与机械预处理、后处理相比，药物处理可能更具实际应用价值[3]。线粒体ATP敏感性钾通道(mitochondrial ATP sensitive potassium channels，mitoKATP)的开放在预处理、后处理中起着重要的作用，它既是预处理、后处理心肌保护效应的终末效应器，又在信号转导中扮演了重要的角色。二氮嗪是mitoKATP的特异性开放剂，可激活内源性心肌保护机制。本实验研究了二氮嗪预处理、后处理及二种处理联合对心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤作用的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 Wistar大鼠48只，体重250～300 g，雄性，由潍坊医学院实验动物中心提供(许可证号:SCXK20050017)。二氮嗪，5-羟基葵酸盐(5-HD)，伊文思兰均购自Sigma公司(GD4061465)。2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)购自于国药集团化学试剂有限公司(批号:F20061215)。SOD、LDH、CK、MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。二甲基亚砜(DMSO)及其他试剂均为市售分析纯产品。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及灌注方法 3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行腹腔注射麻醉，按3 mg/kg经下腔静脉注射肝素。开胸取出心脏，悬挂于Langendorff灌流装置上，温度为(37 ±0.2)℃，用 pH 为7.35 ～7.45 的改良任-乐氏液(mmol/L:NaCl l54.0，KCl 3.4，CaCl21.8，NaHCO33.6，Glucose 5.6)灌注，用95%的 O2和5%的CO2充注，灌注压75 cmH2O。用持针器持小圆针在左冠状动脉前降支根部穿一结扎线，在该结扎线下方约0.5 cm处再穿一结扎线，以备结扎。结扎时采用直径0.2 cm细塑料管穿过结扎线，收紧或松开结扎线以造成心肌缺血再灌注模型。心肌功能测量:剪开左心房经二尖瓣置一聚乙烯球囊于左心室内，通过导管和BL-420E+生物机能仪连接，向球囊内注入适量生理盐水使左室舒张末压(LVEDP)为5～10 mmHg，并维持实验始终。选择心脏标准:平衡灌注末 HR＞160次/min、LVSP＞75 mmHg，每分钟室性早搏＜2个，不符合上述标准者舍弃后另补充。

1.2.2 实验分组 48只大鼠心脏平衡灌注30 min后，随机分为6组。①对照组(Con组):结扎左冠状动脉前降支(left anterior descending artery，LAD)45 min，再灌注120 min。②缺血后处理组(Pos组):在再灌注前先6次短暂开放/钳夹主动脉灌注管(10秒闭塞，10秒再灌注，循环6次)，其余同对照组。③二氮嗪后处理组(Dpo组):在LAD开放时给予二氮嗪(50 μmol/L)。④二氮嗪预处理组(Dpr组):二氮嗪(50 μmol/L)在LAD阻断前灌注10 min。⑤联合组(Cbm组):LAD阻断前、后分别给予二氮嗪(50 μmol/L)灌注10 min。⑥阻滞剂组(Dhb组):二氮嗪(50 μmol/L)与 5-HD(100 μmol/L)混合灌注，其余同联合组。二氮嗪使用前用DMSO溶解，保持终浓度小于0.1%。

1.2.3 观察指标及测定 通过BL-420E+实验系统持续监测连续记录血流动力学数值:心率-收缩压乘积百分数，左心室内压瞬间最大变化速率(±dp/dtmax)，冠脉流量(coronary flow，CF)。

1.2.4 收集平衡灌注20 min时，复灌30 min时冠脉循环流出液，测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性。复灌结束后取缺血区心肌组织测定肌酸激酶(creatine kinase，CK)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)的含量。

1.2.5 线粒体超微结构改变的电镜观察 实验结束时，每组随机留取一个心脏左心室前壁风险区组织用于电镜检查。在H-7500型透射电子显微镜下对线粒体进行Flameng评分[4]。即在每组内随机取5个视野(每个视野包括20个线粒体)，计算每个视野中线粒体评分的平均数，5个视野的均值即为Flameng评分。评分标准为:0分:线粒体结构正常，颗粒完好;1分:线粒体结构正常，但颗粒缺失;2分:线粒体水肿，基质透明、清晰;3分:嵴破裂，基质透明、浓缩;4分:线粒体内、外膜破裂，不完整。

2 结果

2.1 心率-收缩压乘积百分数，左心室内压瞬间最大变化速率(±dp/dtmax)，冠脉流量(CF)的检测结果 与Con组比较，Pos组、Dpo组、Dpr组、Cbm组的心率-收缩压乘积百分数见图1;+dp/dtmax见图2;－dp/dtmax见图3;CF见图4。在缺血前无显著差异性(P ＞0.05)，复灌后 Pos组、Dpo组、Dpr组、Cbm组较Con组恢复好(P＜0.05);Dhb组的5-HD取消了二氮嗪的保护作用;与单独应用二氮嗪预处理、后处理相比，Cbm组中二氮嗪后处理联合预处理没有表现更大的叠加保护作用。

图1 心率-收缩压乘积百分数

图2 左心室内压上升最大速率图

图3 左心室内压下降最大速率图

图4 冠脉流量图

2.2 LDH、SOD、CK 及 MDA 的结果

与Con组比较，Pos组、Dpo组、Dpr组、Cbm 组中心肌灌流液中LDH漏出量减少(P＜0.05)，SOD含量较高(P＜0.05)，Dhb组与Con组比较无显著差别(P ＞0.05)，见表1，2。

与Con组比较，缺血区心肌组织CK及MDA的含量在 Pos组、Dpo组、Dpr组、Cbm组减少(P＜0.05)。与 Pos组、Dpo组、Dpr组比较，Cbm 组中CK及MDA没有表现出更大的叠加保护作用，见表3。

表2 冠脉流出液中SOD(U/mL)

表3 心肌组织CK及MDA

2.3 线粒体Flameng评分

线粒体Flameng评分在Pos组、Dpo组、Dpr组、Cbm 组分别为 1.44 ± 0.88、1.10 ± 0.73、1.50 ±0.92、1.36 ±0.67，各项数值与 Con 组 3.08 ±0.79相比较具有统计学意义(P＜0.05)。Dhb组数值3.14±0.69与Con组比较无显著差别(P＞0.05)。与Pos组、Dpo组、Dpr组比较，Cbm组中线粒体Flameng评分没有表现出更大的叠加保护作用。

3 讨论

对缺血心肌的保护研究一直是心脏学科领域的重点。如何建立有效的药物后处理，有效药物后处理和药物预处理联合使用的关系，是心肌缺血再灌注损伤的保护研究中的重点问题[3]。

心肌缺血时，机体通过酶系统与非酶系统产生氧自由基(oxygen free radical，ROS)，ROS对心肌的损伤主要表现为ROS与心肌细胞膜上的多不饱和脂肪酸结合，引起脂质过氧化作用，形成脂质过氧化物(lipid peroxide，LPO)，引起细胞结构和功能的一系列改变，最终导致心肌细胞的损伤。体内最重要的LPO代谢产物是MDA，故测定MDA能较好地反映组织脂质过氧化程度，间接反映出细胞损伤程度。ROS清除酶如SOD、谷胱甘肽过氧化物酶等的活性降低时，导致ROS堆积，ROS可转变为羟自由基，其活性更强，使膜脂质过氧化，引起细胞膜的结构和功能损害。细胞膜结构遭自由基及脂质过氧化破坏后，可使细胞膜功能失调，进一步促进Ca2+内流增加，造成细胞Ca2+超载，激活Ca2+依赖蛋白水解酶，促进ROS生成，从而加剧缺血组织损伤。SOD是体内清除自由基的一种特异酶，其活性变化可反映体内抗氧化功能情况。

本研究显示，与Con组比较，Pos组、Dpo组、Dpr组、Cbm组的MDA含量明显降低，SOD含量明显增高，表明降低MDA含量、增强SOD活性是机械后处理、二氮嗪预处理、后处理减少心肌缺血再灌注损伤的机制之一。

二氮嗪是线粒体KATP通道选择性开放剂，可激活内源性心肌保护机制，具有抗心肌缺血缺氧损伤的作用。二氮嗪改善心肌缺血再灌注损伤主要是基于mitoKATP的作用。二氮嗪作用于线粒体ATP敏感性K+通道，使线粒体K+通道开放，K+、H2O的内流，导致线粒体基质肿胀，呼吸功能增强，防止线粒体Ca2+超载。可能通过保护线粒体的结构和功能，有利于细胞能量的保存以及防止细胞内酸中毒的发生，减轻再灌注期间线粒体钙超载和活性氧增加，从而抑制线粒体通透性转换孔开放诱导的凋亡和线粒体结构崩解，减轻心肌缺血再灌注损伤[5]。

本研究显示，与单独给予二氮嗪相比，在同时给予二氮嗪和5-HD后，缺血心肌线粒体Flameng评分增高，表明5-HD取消了二氮嗪预处理、后处理的保护作用。

本研究显示，二氮嗪预处理联合后处理对缺血再灌注心肌有保护作用，但却没有表现出叠加保护作用。这和Deyhimy[6]的实验结果一致。而李北方等[7]在实验中发现联合应用能明显增加对大鼠缺血再灌注损伤的保护作用。这种偏差的出现可能归因于不同的动物缺血模型的应用。对于两者是否有叠加效应存在着较大的争论，但确切的理论结果需更多大量的实验研究加以确定[8]。

[1]Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioning with ischemia:a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation，1986，74(5):1124-1136.

[2]Zhao ZQ，Corvera JS，Halkos ME，et al.Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparison with ischemic preconditioning[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2003，285(2):579-588.

[3]Paul Z，Gerczuk MD，Robert A.Protecting the heart from ischemia:an update on ischemic and pharmacologic conditioning[J].Hosp Pract，2011，39(3):35-43.

[4]Flameng W，Borgers M，Daenen W，et al.Ultrastructural and cytochemical correlates of myocardial protection by cardiac hypothermia in man[J].J Thorac Cardiovasc Surg，1980，79:413-424.

[5]Chen Q，Paillard M，Gomez L，et al.Postconditioning modulates ischemia-damaged mitochondria during reperfusion[J].J Cardiovasc Pharmacol，2011，29:202.

[6]Deyhimy DI，Fleming NW，Brodkin IG，et al.Anesthetic preconditioning combined with postconditioning offers no additional benefit over preconditioning or postconditioning alone[J].Anesth Analg，2007，105:316-324.

[7]李北方，刘仁光.远程后处理合并ATP后处理对大鼠缺血再灌注心肌的保护作用[J].广东医学，2010，31(14):1786-1788.

[8]Rohilla A，Rohilla S，Kushnoor A.Myocardial postconditioning:next step to cardioprotection[J].Arch Pharm Res，2011，34(9):1409-1415.