蜂蜜酒生香酵母产酯性能比较和产酯条件研究

陶树兴，苏 蕊，薛 静，田泽英，丛 寅，柴 霞

（陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710062）

蜂蜜酒生香酵母产酯性能比较和产酯条件研究

陶树兴，苏 蕊，薛 静，田泽英，丛 寅，柴 霞

（陕西师范大学生命科学学院，陕西西安710062）

对6株生香酵母在蜂蜜酒发酵中的产酯性能进行比较，探讨生香酵母的产酯条件，为蜂蜜酒的发酵提供参考。结果表明，异常汉逊酵母异常变种（Hansenula anomala var.anomala）1437产酯最高，为0.8431 g/L；该菌株产酯开始时的乙醇浓度以5%～6%比较合适，最适pH为5，最适温度为25～28℃，装液量以40%～50%较好，连续振荡不利于产酯；接种生香酵母2d后再接入1%酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）1306能促进异常汉逊酵母异常变种1437产酯。

蜂蜜酒，生香酵母，总酯，产酯条件

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

异常汉逊酵母异常变种（Hansenula anomala var. anomala）1437、1427、1312，异常毕赤酵母（Pichiaanomala）1851，伯顿拟内孢霉（Endomycopsis burtonii）31347，季也蒙假丝酵母季也蒙变种（Candida guilliermondii var.guilliermondii）1274，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）197、1306 均由中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）提供；酿酒活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；荆条蜜 由山西沁花蜂业有限公司提供；酵母膏 生化试剂；葡萄糖、磷酸氢二铵、磷酸二氢钾、氯化镁、酒石酸钾钠、硫酸铜、次甲基蓝、氢氧化钠、浓硫酸、对二甲氨基苯甲醛、邻苯二甲酸氢钾、乙醇、无水碳酸钠、溴甲酚绿、甲基红 均为分析纯试剂；异丁醇、异戊醇 为色谱试剂；斜面种子培养基（g/L） 葡萄糖50g，酵母膏2g，KH2PO40.2g，（NH4）2HPO40.5g，琼脂20g，10%豆芽汁1000mL，pH自然；液体种子培养基（g/L） 蜂蜜70g，酵母膏2g， KH2PO40.2g，（NH4）2HPO40.5g，MgCl20.1g，10%豆芽汁1000mL，pH自然；蜂蜜酒发酵培养基（g/L） 蜂蜜230g（还原糖161g），酵母膏0.1g，KH2PO40.1g，（NH4）2HPO40.25g，MgCl20.1g，5%豆芽汁1000mL，pH5。

立式压力蒸汽灭菌锅、SPX-250B-D恒温振荡培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LRH-250A生化培养箱 广东省医疗器械厂；U-1810紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；SL电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；水蒸气蒸馏装置，全玻璃蒸馏器，酒精计，全玻璃回流装置，回流瓶，酸式滴定管，碱式滴定管等。

1.2 实验方法

1.2.1 种子制备 将生香酵母菌种1437、1427、1312、31347、1851、1274接于斜面种子培养基，28℃培养3d。将斜面菌种用5mL液体培养基洗下，再转入50mL液体种子培养基中，28℃，160r/min振荡培养24h得液体种子。

1.2.2 蜂蜜酒发酵 在500mL的三角瓶中装入200mL蜂蜜酒发酵培养基，分别接入生香酵母种子液20mL，用聚丙烯薄膜封口，28℃培养10d，使酒精度达到5%左右；然后用8层纱布替换聚丙烯薄膜，28℃培养10d，完成产酯过程；发酵结束后测定酒精度、还原糖、总酯、总酸和杂醇油。乙醇含量对产酯的影响、装液量及振荡对产酯的影响是直接在发酵培养基中添加乙醇后，进行产酯发酵。

1.3 分析方法

依据GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[9]，酒精度测定用酒精计法；还原糖用菲林试剂直接滴定法；总酸测定用指示剂法。依据GB/T 10345-2007《白酒分析方法》，用指示剂法测定总酯[10]。杂醇油测定用二甲氨基苯甲醛比色法[11]。

1.4 数据处理

实验数据采用SPSS软件进行方差分析，均值比较采用Duncan检验。

2 结果与讨论

2.1 蜂蜜酒发酵中生香酵母产酯性能比较

6株生香酵母分别发酵产酯。发酵结束后，酒精度、残糖、总酯、总酸、杂醇油含量和感官特征的测定结果列于表1。

由表1可以看出，异常汉逊酵母异常变种1437总酯含量最高，为0.8431g/L；季也蒙假丝酵母季也蒙变种1274发酵液总酯含量最低，为0.2051g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，1437与其它5个菌株之间的总酯含量有显著差异（P＜0.05）。1437酒精度为4.77%（V/V），还原糖为10.20g/L；异常汉逊酵母异常变种1427酒精度为4.56%（V/V），还原糖为10.29g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，1437和1427与其他4个菌株之间的酒精度及还原糖有显著差异（P＜0.05）。

1274总酸含量最高，为3.030g/L，1427总酸含量最低，为2.413g/L。方差分析及Duncan多重比较显示,不同菌株之间的总酸含量有显著差异（P＜0.05）。1437杂醇油含量最低，为0.079g/L；1274杂醇油含量最高，为0.101g/L。方差分析及Duncan多重比较显示,不同菌株之间的杂醇油含量有显著差异（P＜0.05）。

蜂蜜酒中的酯类物质主要是乙酸乙酯，是生香酵母在醇酰基转移酶AATas的作用下生成酯酰辅酶A，再由酯酶催化醇和酯酰辅酶A化合生成酯[12]。酵母菌种是影响蜂蜜酒中酯含量的首要因素，不同菌种细胞内酯酰辅酶A的活性和产生量均不相同，生成酯的能力也不相同[13]。

杂醇油是在酿造酒的过程中,由蛋白质、氨基酸以及糖类化合物分解而成的具有强烈气味的高级醇类，主要包括丙醇、异丙醇、丁醇、异丁醇、戊醇、异戊醇、己醇和庚醇等[14]。杂醇油是白酒中醇甜和助香剂的主要物质，也是形成香味物质的前驱物质，含量过多会导致酒辛辣，苦涩。高级醇在人体内氧化速度慢，停留时间长，会引起头痛，神经系统充血等症状[15]。国标规定白酒中杂醇油的含量为≤0.20g/100mL（以异丁醇、异戊醇计）。

蜂蜜酒中的总酸是蜂蜜原汁酸和酵母菌代谢酸的总和[16]。适量的酸能使酒体醇厚爽口，平衡酒中苦味。综合上述实验结果可知，异常汉逊酵母异常变种1437总酯含量及酒精度最高，酸度适中，杂醇油含量最少，口感好，适用于蜂蜜酒的发酵产酯实验。

2.2 蜂蜜酒发酵中乙醇含量对生香酵母产酯的影响

蜂蜜酒发酵培养基中添加无水乙醇，使乙醇含量依次为3%、4%、5%、6%、7%，然后进行发酵产酯。发酵结束后测定酒精度、残糖、总酯、总酸、杂醇油，结果见表2。

由表2可知，乙醇含量5%～6%时总酯含量最高，分别为0.8172、0.8069g/L；乙醇含量3%时总酯含量最低，为0.6207g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，乙醇含量5%～6%与其他浓度之间的总酯有显著差异（P＜0.05）。乙醇含量5%时酒精度最高，为6.607%（V/ V）；3%时酒精度最低，为6.460%（V/V）。方差分析显示，不同乙醇含量之间的酒精度无显著差异（P＞0.05）。乙醇含量7%时残糖含量最高，为97.09g/L；3%时残糖含量最低，为46.03g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，不同乙醇含量之间的残糖含量有显著差异（P<0.05）。

表1 蜂蜜酒发酵中生香酵母的产酯性能比较

表2 乙醇含量对蜂蜜酒发酵中生香酵母产酯的影响

表3 pH对蜂蜜酒发酵中生香酵母产酯的影响

表4 温度对蜂蜜酒发酵中生香酵母产酯的影响

乙醇含量3%时总酸含量最高，为3.066g/L；7%时总酸含量最低，为2.560g/L。方差分析及Duncan多重比较显示,不同乙醇含量之间的总酸含量有显著差异（P<0.05）。乙醇含量3%时杂醇油含量最高，为0.111g/L；7%时杂醇油含量最低，为0.071g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，不同乙醇含量之间的杂醇油含量有显著差异（P<0.05）。

可见添加适量的乙醇有利于生香酵母产酯，其中以加入5%的乙醇时产酯效果最好，但添加乙醇过量将会对生香酵母产酯产生抑制作用。

2.3 蜂蜜酒发酵中pH对生香酵母产酯的影响

用乙酸将发酵液pH分别调至3、3.5、4、4.5、5、5.5、6进行发酵。发酵结束后测定酒精度、残糖、总酯、总酸、杂醇油，结果见表3。

由表3可知，pH 5时总酯含量最高，为0.8069g/L；pH3时总酯含量最低，为0.5917g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，pH5与其它pH之间的总酯有显著差异（P<0.05）。pH5时酒精度最高，为4.4%（V/V），还原糖为11.02g/L；pH 5.5时，酒精度为4.34%（V/V），还原糖为11.05g/L。方差分析及Duncan多重比较显示, pH5~5.5与其它pH之间的酒精度、还原糖有显著差异（P<0.05）。

pH6和pH5.5时总酸含量最高，均为3.242g/L；pH3.5时总酸含量最低，为2.608g/L。方差分析及Duncan多重比较显示,不同pH之间的总酸含量有显著差异（P<0.05）。pH3时杂醇油含量最高，为0.119g/L；pH6时杂醇油含量最低，为0.053g/L。方差分析及Duncan多重比较显示,不同pH之间的杂醇油含量有显著差异（P<0.05）。

以往研究表明，在pH5.0~5.5或偏酸性环境中生长的酵母，其活性和酒精耐受性高，有利于乙醇的积累，发酵酒精能力好。而pH≥7.6，即偏碱性时，会导致发酵产生的中间产物乙醛不能正常作为受氢体，而在两分子乙醛之间发生歧化反应,相互氧化还原，生成甘油和等量的乙醇和乙酸，减少乙醇的产量。发酵液的pH对酯酶亦产生影响，当pH为4.5~6.5时有利于酯酶催化酯的合成，pH＞7.5或pH＜4.5时酯酶就会分解酯[16]。本次实验中，pH=5时，测定总酯含量显著高于其它处理组，与以往的研究结果相一致。

2.4 蜂蜜酒发酵中温度对生香酵母产酯的影响

发酵液分别在23、25、28、30、32、34℃的恒温培养箱中培养，发酵结束后测定酒精度、残糖、总酯、总酸、杂醇油，实验结果见表4。

从表4可以看出，28℃发酵时总酯含量最高，为0.7862g/L；25℃时总酯含量为0.7755g/L；34℃时总酯含量最低，为0.6724g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，25~28℃发酵与其它温度之间的总酯含量有显著差异（P<0.05）。28℃发酵时酒精度最高，为4.65%（V/V），还原糖为10.95g/L；25℃时，酒精度为4.55%（V/V），还原糖为11.12 g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，25~28℃与其它发酵温度之间的酒精度及还原糖有显著差异（P<0.05）。

28℃发酵时总酸含量最高，为3.827g/L；23℃时总酸含量最低，为2.559g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，不同温度之间的总酸含量有显著差异（P<0.05）。23℃发酵时杂醇油含量最低，为0.054g/L；34℃时杂醇油含量最高，为0.110g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，不同温度之间的杂醇油含量有显著差异（P<0.05）。

表5 装液量和振荡对蜂蜜酒发酵中生香酵母产酯的影响

温度是影响酵母菌生长、发酵的重要因素。发酵期间温度升高，酒精发酵旺盛，糖降快，酵母在糖降过程中积累较多的ATP使辅酶A活性增强，促进酯类的生成[17]。此外，酵母细胞膜的流动性增加，通透性得到提高，促进细胞内的酯类的渗出，增加了蜂蜜酒中酯类的含量。若培养温度过高,酵母出芽率会降低,衰老加快，酒精度呈下降趋势，酯类生成减缓。上述观点在本次实验中得到进一步的验证，当发酵温度从23℃提高到28℃，总酯含量也从0.6517g/L上升到0.7862g/L，但随着温度进一步提高，总酯含量呈下降趋势，34℃发酵时总酯含量下降到0.6724g/L。

2.5 蜂蜜酒发酵中装液量和振荡对生香酵母产酯的影响

蜂蜜酒发酵中，不同装液量及是否振荡对生香酵母1437产酯的影响结果见表5。

从表5可以看出，装液量为200mL和250mL且不振荡时总酯含量最高，分别为0.8172、0.7679g/L；装液量为200mL，160r/min振荡培养10d后总酯含量最低，为0.4345g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，装液量为200~250mL时的总酯含量显著高于其它处理组（P<0.05）。

装液量为200mL且不振荡时酒精度最高，为7.58%（V/V）；装液量为200mL，160r/min振荡培养10d后酒精度最低，为1.95%（v/v）。方差分析及Duncan多重比较显示，不同装液量及振荡之间的酒精度有显著差异（P<0.05）。发酵液在160r/min振荡培养10d后,残糖含量最高，为89.56g/L；在200mL且不振荡时残糖含量最低，为47.73g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，不同装液量及振荡之间的残糖有显著差异（P<0.05）。

发酵液在160r/min振荡培养10d后总酸含量最高，为4.716g/L；装液量为300mL时总酸含量最低，为2.436g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，不同装液量及振荡之间的总酸有显著差异（P<0.05）。发酵液在160r/min振荡培养10d后杂醇油含量最低，为0.052g/L；装液量为300mL时杂醇油含量最高，为0.092g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，不同装液量及振荡之间的杂醇油有显著差异（P<0.05）。

结果表明，发酵液静止培养比振荡培养产酯量高。可能是由于发酵液振荡培养，生香酵母以生长繁殖为主,细胞消耗较多的碳、氮营养用以合成菌体,使产酯量受到影响。

2.6 接种酿酒酵母对蜂蜜酒发酵中生香酵母产酯的影响

选用L9（34）正交表安排实验，因素水平见表6，结果及总酯的极差分析见表7。

表6 正交实验因素水平表

由表7可见，接种量对生香酵母1437产酯影响最大，接种菌种和接种时间对其影响较小。方差分析及Duncan多重比较显示，接种量1%与其它接种量之间的总酯含量有显著差异（P<0.05）；最优因素水平组合为A2B1C3。按最优因素水平组合A2B1C3进行验证实验，以产酯量最高的4号实验的水平组合为对照，组合A2B1C3三次重复实验所产总酯分别为0.9476、0.9342、0.9463g/L,其均值为0.9427g/L。对照所产总酯分别为0.8489、0.8628、0.8764g/L,其均值为0.8627g/L。方差分析及Duncan多重比较显示，最优因素水平组合A2B1C3的产酯量显著高于对照（P＜0.05）。

表7 正交实验结果及总酯极差分析

3 结论

本文对6株生香酵母在蜂蜜酒发酵中的产酯性能进行了比较，并探讨了乙醇含量、pH、温度、装液量及振荡、接种酿酒酵母对生香酵母发酵和产酯能力的影响。结果表明，在蜂蜜酒发酵中，异常汉逊酵母异常变种1437产酯能力高；添加乙醇和接入酿酒酵母都有利于异常汉逊酵母异常变种1437产酯，但从总酯含量和酒的口感来看，以接种生香酵母（10%）的2d后接入1%的酿酒酵母1306较好；产酯开始时乙醇的含量以5%～6%比较合适，最适pH为5；产酯最适温度为25～28℃，装液量以40%～50%较高，连续振荡不利于产酯。

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Comparison of the ability and condition of ester production of the aroma yeast in mead fermentation

TAO Shu-xing，SU Rui，XUE Jing，TIAN Ze-ying，CONG Yin，CHAI Xia
（College of Life Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Compared with the ability of ester production of the 6 strains of aroma yeast and discussed the condition of ester production of the aroma yeast in mead fermentation.The results showed that the strain of the highest production total ester content was Hansenula anomala var.anomala 1437，which was 0.8431g/L.For 1437，the good condition of producing ester were as follow:the initial alcohol contents was 5%～6%，the pH was 5，the fermentation temperature was at 25～28℃，loading volume was 40%～50%，continuous oscillations prevent producing ester，after two days of fermentation，adding 1%Saccharomyces cerevisiae 1306 increased the total ester contents in mead.

mead；the aroma yeast；total ester；the condition of ester production

TS201.3

A

1002-0306（2011）10-0234-05

蜂蜜酒是以蜂蜜为主要原料经酿酒酵母发酵而成，含有一定酒精度的饮用酒[1]。现有专利、文献、生产厂家生产蜂蜜酒，通常是使用酿酒酵母作为发酵剂，这种蜂蜜酒酒味明显，但香气不足，口感欠佳[2]。为了改善蜂蜜酒的口感，人们从蜂蜜选择、酿酒酵母筛选、发酵温度等多方面进行了研究[3-6]。生香酵母具有产酯生香和一定的酒精发酵能力，在白酒固态发酵生产中采用生香酵母提高酒的酯含量已有很多成功的经验[7]，在黄酒生产方面，也有同时使用酿酒酵母和生香酵母的文献[8]。在蜂蜜酒发酵中，生香酵母能否发挥作用，有必要进行研究。本文对6株生香酵母在蜂蜜酒发酵中的产酯性能进行了比较，并对异常汉逊酵母异常变种（Hansenula anomala var.anomala）1437产酯生香的条件进行了研究。

2010-11-25

陶树兴（1955-），男，副教授，主要从事应用微生物学研究。

陕西省社会发展攻关项目（2009k11-03）。