固定化β-半乳糖苷酶的催化特性研究

宋景深，陈振鹏，邓宝浣，陈子健

（江门量子高科生物股份有限公司，广东江门529081）

固定化β-半乳糖苷酶的催化特性研究

宋景深，陈振鹏，邓宝浣，陈子健

（江门量子高科生物股份有限公司，广东江门529081）

β-半乳糖苷酶经固定化后，其催化性能得到一定程度的改善。在各种反应条件相同的条件下，固定化酶的最适反应条件与游离酶相比得到一定程度的拓宽：受反应温度变化的影响变小，pH从5.8～6.2扩宽至5.7～6.5；对乳糖的转化效率有了不少的提高，酶的稳定性也得到了加强。实验中固定化β-半乳糖苷酶重复使用28次，底物转化率均在45%以上，具备了一定实际应用能力。

β-半乳糖苷酶，固定化，催化特性

低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，简称GOS）可以促进肠道内双歧杆菌（Bifidobacteria）和乳酸杆菌等有益菌的生长，是一种益生元（prebiotics）。低聚半乳糖是以乳糖为原料，经β-半乳糖苷酶（EC3.2.1.23）作用转化而成[1]。可将β-半乳糖苷酶固定化，固定化酶具有催化效率高、稳定性高、低能耗、低污染等优点，将β-半乳糖苷酶固定化后用于生产，可提高酶的利用率，节省生产成本。本研究中固定化酶是以树脂为载体，经吸附作用制作而成。酶被固定化以后，由于受到多方面的影响，与游离酶相比较，其微观结构等往往会发生改变，对底物的转化特性也可能随之而变[2]。如：受扩散现象影响，酶固定在多孔载体，由于受到质量传递限制，酶活力可能会受到扩散现象影响；受空间构型影响，因酶的比活力非常依赖于所用载体的本身性质，另外酶固定化疏水性载体和亲水性载体的差异性很大；受微环境影响，微环境是指吸附的酶分子周围的载体性质，其可能会对酶的特性产生影响；受载体孔径大小影响，载体孔径过小，酶无法进入被吸附或者吸附后容易受到扩散限制；载体孔径过大，酶被吸附后有可能引起酶构型的改变。可见，酶在固定化以后可能会受到多个方面的影响，固定化酶的特性与游离酶相比较可能发生变化。本研究在以上理论基础上，摸索β-半乳糖苷酶被树脂固定化后的性质变化情况，观察对乳糖转化的特性是否受到影响，各转化参数是否有变化。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

β-半乳糖苷酶 江门量子高科生物股份有限公司；吸附树脂 天津南开和成科技有限公司；乳糖购自戴维林国际贸易有限公司（荷兰DMV乳糖）；蒸馏水 自制；0.5mmol的氢氧化钠溶液 自配；pH6.0缓冲液 磷酸缓冲液（自配）。

水浴摇床 常州澳华仪器有限公司；可调电炉长沙市远东电炉厂；三角瓶、烧杯、玻棒 购自江门国侨科技仪器公司。

1.2 实验方法

转化率检测方法参照低聚半乳糖的高效液相色谱测定法[3]，转化率（%）以低聚半乳糖含量计。

转化反应的影响因素主要有底物浓度、反应液pH、反应温度、搅拌速度等。固定化酶转化生产低聚半乳糖反应条件确定主要从这些因素着手。研究中比较游离酶的各反应条件，观察酶被固定化以后反应特性是否发生了变化。

固定化酶的制备：用250mL三角瓶称取3g的吸附树脂，加入100mL蒸馏水后放入摇床，室温条件下摇动活化2h，取出后将蒸馏水倒干净；量取10mL缓冲液（pH6.0）转入100mL三角瓶，吸取总活力500U的液态β-半乳糖苷酶加入三角瓶，溶于缓冲液；将完成活化的树脂倒入装有酶液的三角瓶，然后置于6℃冷冻摇床摇动吸附，吸附24h。完成吸附后倒掉吸附残留液，用蒸馏水将固定化酶清洗干净。制作若干份固定化酶，存放于4℃冰箱，待用。

1.2.1 pH对反应转化率的影响研究 用三角瓶分别配制两组乳糖溶液，每组各5份，干物质浓度50%±1%（50g乳糖+50mL蒸馏水），加热完全溶解后降温至55℃，然后使用氢氧化钠溶液将其中4份乳糖溶液的pH调至5.0±0.1、6.0±0.1、7.0±0.1，另外一份乳糖溶液保留在自然pH（4.2），两组操作相同，以作对比。在第一组的五份乳糖溶液中加入4mL游离酶（125U/mL），在第二组的五份乳糖溶液中加入3g固定化酶（166U/g），然后将所有乳糖溶液置于同一水浴摇床进行酶解反应，控制温度55℃，反应过程每隔1h用氢氧化钠溶液校对一次pH。

1.2.2 反应温度对转化率的影响研究 设定四个温度梯度：50、55、60、65℃，用三角瓶分别配制两组乳糖溶液，每组各4份，浓度50%±1%（50g乳糖+50mL蒸馏水），加热完全溶解，降温至60℃后在第一组的4份乳糖溶液中加入4mL游离酶（125U/mL），在第二组的4份乳糖溶液中加入3g固定化酶（166U/g），然后分别置于50、55、60、65℃水浴摇床中。

1.2.3 底物浓度对转化率的影响研究 配制两组乳糖溶液，每组各4份，浓度分别为40%±1%、45%±1%、50%±1%、55%±1%，加热完全溶解后降温至60℃时在第一组的4份乳糖溶液中分别加入4mL游离酶（125U/mL），在第二组的4份乳糖溶液中分别加入3g固定化酶（166U/g），两组反应液都置于65℃水浴摇床进行反应。

1.2.4 米氏常数Km的测定 分别在两组4个250mL的三角瓶中用pH6.0的磷酸盐缓冲液分别配制0.0585、0.0877、0.1170、0.1462mol/L的乳糖溶液，在两组溶液中分别加入相同的总酶量50U的游离酶和固定化酶，在65℃下反应60min，分别测定其生成含量最高的转移三糖的量，并计算反应速度。

1.2.5 酶的半衰期测定 分别称量2份游离酶和2份固定化酶，每份游离酶4mL，每份固定化酶3g，分别放入pH6.0的醋酸盐缓冲液中，置于65℃条件下进行保温，分别在保存的第0、5、10、15d取出一份游离酶和一份固定化酶进行酶活检测，据此测定游离酶和固定化酶的半衰期。

1.2.6 固定化酶使用寿命的测定 在250mL中配制固形物含量50%的乳糖溶液，加入3g固定化酶，置于65℃水浴摇床摇动反应，当反应液中GOS含量达到45%以上，停止反应；回收固定化酶，重复上述步骤，直至GOS含量低于45%。

2 结果与讨论

2.1 pH对反应转化率的影响

反应16h后每隔2h分别从两组反应液中取样，取样后第一组反应液升温至100℃灭酶1min，第二组反应液用纱布滤去固定化酶，然后用高效液相色谱检测转化率，比较游离酶和固定化酶在不同pH条件下的乳糖转化率，直至转化率开始下降，停止取样。每一份反应液都是在进行到24h后转化率最高，当反应进一步进行，部分的低聚半乳糖将分解成单糖，而且随着时间的推移，低聚半乳糖的损失增多。

图1 反应液pH对游离酶和固定化酶转化效率的影响

从图1可见，酶在被固定化以后最适pH有所偏移，游离酶的最适pH为5.8～6.2，而固定化酶的最适pH为5.7～6.5，最适pH范围更宽。另外，从图中可见，与游离酶比较，在相同的条件下，固定化酶催化乳糖转化的效率更高。

2.2 反应温度对反应转化率的影响

反应24h后取样，第一组反应液升温至100℃灭酶1min，第二组反应液用纱布滤去固定化酶，然后用高效液相色谱检测转化率，比较游离酶和固定化酶在不同温度条件下的乳糖转化率。

图2 反应温度对游离酶和固定化酶转化效率的影响

从图2的结果来看，随着反应温度的升高，在相同的反应时间内，游离酶和固定化酶对乳糖的转化率都升高，因为所用的酶为耐高温酶，可耐受温度80℃以上，但考虑到载体树脂所能耐受的温度为65℃，设定固定化酶的最适反应温度为65℃。固定化酶和游离酶比较，随着反应温度的下降，固定化酶的转化率下降幅度较游离酶的小，从不同反应温度角度来说，酶经大孔树脂固定化以后稳定性升高，受反应温度变化的影响较小。

2.3 底物浓度对反应转化率的影响

图3 底物浓度对反应转化率的影响

反应24h后分别取样检测低聚半乳糖含量（转化率），观察在不同底物浓度条件下游离酶和固定化酶的乳糖转化率。

从图3可见，无论是游离酶或是固定化酶，底物浓度为40%、45%时乳糖转化率较低，而当底物浓度为50%时乳糖转化率最高，酶的固定化酶并没有改变此特性。而在同一条件下，固定化酶受底物的影响更低，乳糖转化率更高。

2.4 酶的动力学常数

以双倒数作图法测定游离酶和固定化酶的米氏常数Km，如图4，游离酶的Km=449mmol/L，Vmax= 4.560mmol·L-1·min-1；固定化酶的Km=289mmol/L，Vmax=3.605mmol·L-1·min-1。

图4 游离酶和固定化酶的Lineweaver-Burk双倒数曲线

从动力学常数来看，β-半乳糖苷酶被固定化以后，对底物的亲和力更强，催化乳糖转化成低聚半乳糖的速度被提高。

2.5 半衰期检测

图5 时间与log（E/Eo）值对应曲线

β-半乳糖苷酶酶活检测方法参照文献[10]中所描述的检测方法，根据公式计算半衰期：t1/2=0.693/KD

式中：KD=-2.303/t·log（E/Eo），为衰减常数，其中E为第5、10、15d检测酶活平均值，Eo为第0d检测酶活平均值。

以时间与对应的log（E/Eo）值做标准曲线，如图5所示。

按照公式所计算出来的游离β-半乳糖苷酶半衰期为27d，而固定化β-半乳糖苷酶半衰期为34d，进一步证明酶被固定化以后稳定性提高。

2.6 固定化酶使用寿命

游离酶因为无法回收，所以只能使用一次，而固定化酶在间歇式反应中可以通过分离来重复使用，随着使用次数的增加，酶活力逐渐衰减。通过间歇式反应实验的观察，证实一批固定化β-半乳糖苷酶可反复使用28次，每次反应转化率都在45%以上。

3 结论

经研究发现，与游离酶相比较，β-半乳糖苷酶经固定化以后，酶的最适pH范围产生了偏移，从5.8～6.2扩宽至5.7～6.5，而最适反应温度、最适底物浓度并没有发生改变，但稳定性比游离酶高，但在各种反应条件相同的条件下，固定化酶比游离酶反应转化效率更高。酶在固定化以后米氏常数Km变小，从游离酶时的449mmol/L变为固定化后的289mmol/L；半衰期延长，比游离酶延长了7d，说明经固定化以后酶的特性得到了进一步改善。使用固定化酶方法生产低聚半乳糖，将很大程度上节省生产成本，提升生产效率，提高产品质量，将推动低聚半乳糖甚至低聚糖行业在我国的进一步发展。

[1]郑健仙.功能性低聚糖[M].北京：化学工业出版社，2004：104-109.

[2]曹林秋.载体固定化酶-原理、应用和设计[M].北京：化工出版社，2008：53-72.

[3]白鸿.保健食品功效成分检测方法[M].北京：中国医药出版社，2011：103-110.

Study on catalytic characteristics of immobilizated β-galactosidase

SONG Jing-shen,CHEN Zhen-peng,DENG Bao-huan,CHEN Zi-jian
（Quantum Hi-tech Biological Co.,Ltd.，Jiangmen 529081，China）

Comparing to free enzyme，the catalytic characteristics of immobilizated β-galactosidase were modified.The ranges of optimum reactive conditions have been extended:the influence of temperature became smaller，pH widened to 5.7～6.5 from 5.8～6.2.The conversion rate of substrate becomes higher and the stability of enzyme has been enhanced.Having been re-used for 28 times，the conversion rate of substrate keeps being more than 45%.

β-galactosidase；immobilization；catalytic characteristics

TS201.2+5

A

1002-0306（2011）10-0092-03

2011－08－12

宋景深（1979-），男，研究生，食品工程师，研究方向：低聚糖生产技术研究。