牛黄消炎片微生物限度检查方法探讨

江苏省泰州市药品检验所（225300）季大伟 钱桂英

药理实验证明，牛黄消炎片主要成分大黄和人工牛黄对金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用。《中国药典》2005年版规定，具有抑菌活性的药品进行微生物限度检查时必须消除供试液的抑菌活性后再依法检查。然而，本研究在日常监督检验中发现，仅牛黄消炎片一个品种，不同的生产单位在进行微生物限度细菌计数检查时，采用的消除供试液抑菌活性的方法各不相同，给基层监督检验工作带来很大困难。本研究旨在对由7个生产单位涉及常规法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法及薄膜过滤法的牛黄消炎片细菌计数检查方法按《中国药典》2005年版规定进行再验证，促进以品种确定方法工作的开展。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 HTY-760匀浆仪，PL202-L便携式电子天平，0412-1型离心机。

1.2 试剂 培养基：营养琼脂培养基、营养肉汤培养基；稀释剂：pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液（稀释供试品用），0.9%无菌氯化钠溶液（稀释菌液用）。

1.3 菌种 大肠埃希菌Escherichia coli[C M C C（B）4 4 1 0 2]，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CMCC（B）26003]，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis[CMCC（B）63501]，由中国药品生物制品检验所提供，传代次数均为三代。样品信息见附表1。

2 方法与结果

2.1 供试液制备 称取供试品10g，加pH值7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪粉碎，混匀，作为1:10的供试液。

2.2 菌液制备 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许于营养肉汤培养基中，35℃培养18～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液，备用。2.3 回收率试验方法 试验组：①常规法：取供试液1ml和50～100cfu试验菌同时加入平皿中，立即倾注15ml～20ml营养琼脂培养基，按规定培养，菌落计数。每株试验菌平行制备两个平皿。②培养基稀释法（0.2ml•皿-1）：取供试液1ml按每一平皿0.2ml分置5个平皿中，每一平皿分别加入50～100cfu试验菌。③离心沉淀集菌、薄膜过滤联用法：取供试液10ml置离心管中，500RPM×3min离心后取全部上清液置无菌试管中，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液补足10ml，再从中取1ml，加适量稀释剂，依法按薄膜过滤法处理，冲洗量500ml（100ml×5次）。

2.3.2 菌液组 测定所加的试验菌数。

2.3.3 供试品对照组 除不加试验菌外，其余操作同试验组，测定本底菌数。

2.3.4 回收率（%）=（试验组菌数-供试品对照组菌数）/菌液组菌数×100%

2.4 方法的确立 为了解样品的抑菌活性情况，采用常规法进行回收率试验，根据预试验结果，确定消除抑菌活性的方法并进行验证。预试验结果见附表2。由附表2可知，7个样品的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的回收率均大于70%；除3号样品外，其他6个样品的枯草芽孢杆菌回收率均低于70%，不能采用常规法进行样品细菌计数检查，故无法把细菌计数方法统一为常规法。针对枯草芽孢杆菌抑制的情况采用②法进行回收率试验，结果见附表3。由附表3可知，采用②法，除2、3号样品外，其他5个样品的金黄色葡萄球菌回收率均低于70%，不能采用②法进行样品细菌计数检查，故无法把细菌计数方法统一为培养基稀释法。针对枯草芽孢杆菌抑制的情况采用③法进行回收率试验，结果见附表3。由附表4可见，采用③法，所有供试品的金黄色葡萄球菌回收率均高于70%。

2.4 方法的验证 采用③法进行3次独立的平行试验。由附表5可见，3次平行试验回收率均大于70%，表明该法能有效消除牛黄消炎片抑菌作用，可将牛黄消炎片细菌计数方法统一为离心沉淀集菌法-薄膜过滤法联用。

3 结果与结论

微生物限度检查方法：细菌计数采用离心沉淀集菌法-薄膜过滤法，霉菌和酵母菌计数及控制菌检查均采用常规法。

4 讨论

4.1 根据生产企业提供的验证资料，5号样品采用离心沉淀集菌法-薄膜过滤法联用。对于需要离心沉淀特殊处理的供试品，《中国药典》2005年版规定应增加稀释剂对照组，且在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率均应不低于70%。在试验中，稀释剂对照组按上述方法处理后，其菌回收率存在较大偏差，离心处理对细菌回收影响较大，尤其是金黄色葡萄球菌。有文献报道，细菌菌体本身易吸附于大于20μm的微粒上，因此，《中国药典》2010年版明确规定，离心沉淀集菌法仅适用于微生物限度检查供试液的制备，并且应尽量避免使用，且不可使用快速离心。为此将两次离心修改为一次离心：500RPM离心，不超过3分钟。由试验可知，按500RPM离心5min后取上清液弃沉淀的处理方式会把吸附于供试品中的细菌、霉菌和酵母菌随沉淀一同弃去，导致回收率达不到要求，从而离心沉淀集菌法是一种需改进的方法。

附表1 样品信息

附表2 常规法预试验结果

附表3 枯草芽孢杆菌按②法回收率试验结果

附表4 枯草芽孢杆菌按③法回收率试验结果

附表5 3次平行验证试验结果

4.2 全国已有生产批准文号的牛黄消炎片58个。由于地域原因，本研究只能采集到7个生产厂家的样品进行试验，但本次试验样品的验证资料中囊括了常规法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法和薄膜过滤法，使实验结果具有了代表性。

4.3 目前《中国药典》2010年版已对若干个品种的微生物限度检查方法做出统一规定，足以表明以品种建立微生物限度检查方法已经受到重视。本研究对牛黄消炎片的微生物限度检查方法进行了探讨性试验，为新版药典的修订提供了数据支持。