苯巴比妥原料有关物质测定方法的比较

徐 飞

(南通精华制药股份有限公司，江苏南通226006)

苯巴比妥化学名为5－乙基－5－苯基－2，4，6(1H，3H，5H)－嘧啶三酮，是我公司生产的一种镇静催眠和抗惊厥原料药，用于焦虑、失眠、癫痫及惊厥.本公司在2007年申报的欧洲CEP注册时递交了一个企业内部的HPLC方法对苯巴比妥的有关物质进行控制，这种方法使用的是梯度洗脱，检测时间较长，当时主要考虑对苯巴比妥的起始原料苯基乙基丙二酸二乙酯及其中的一些杂质进行控制，今年4月份欧洲EP7.1颁布了苯巴比妥的新检测方法，所以对两者方法进行适当的分析对比.

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters600泵，486检测器，717自动进样器，Empower色谱软件.

1.2 药品和试剂 苯巴比妥二级标准品(本公司制备)，苯巴比妥产品(本公司生产)，甲苯比妥工作标准品(泰兴森萱)，苯巴比妥杂质 A、B(从 EDQM购买)，甲醇为色谱纯(Merk公司)，其余试剂为分析纯.

2 方法与结果

2.1 色谱条件 CEP规格方法测试苯巴比妥的有关物质，方法为:色谱柱Cs/Cm L1(4.0 mm ×250 mm，5 μm，Waters公司)，流动相A:乙酸钠三水化合物pH4.5，流动相B:甲醇流速 1.0 mL·min－1，检测波长 220 nm，进样量 10 μL，梯度洗脱方法见表1.

表1 CEP测定梯度洗脱方法

EP7.1的方法为:流动相为:缓冲溶液 －甲醇 =60∶40，缓冲溶液:将6.6 g乙酸钠溶于900 mL超纯水，加入3 mL冰醋酸，再用冰醋酸调节pH至4.5，然后用水稀释至1 000 mL，流速 1.0 mL·min－1，检测波长254 nm，进样量20 μL.柱温为室温.均是采用外标法对杂质进行计算.

2.2 样品制备

2.2.1 对照品溶液的制备 分别制备苯巴比妥自身对照液、杂质A和杂质B浓度为0.005 mg·mL－1的甲醇溶液.

2.2.2 样品溶液的制备 精密称取苯巴比妥样品，用甲醇配制成5 mg·mL－1的样品溶液.

2.3 系统适用性和专属性比较 按EP7.1的方法在杂质A和B的混合溶液谱图中计算出A和B之间的分离度为1.97，配制6个苯巴比妥工作标准品的溶液计算其重复性RSD为0.5%，有很好的重复性.分别采用杂质A和B及混合样，图谱显示各峰独立清晰且无任何溶剂的干扰.CEP规格方法对杂质A和B的分离度不能达到大于1.5的要求，且因其梯度洗脱，所以整个基线波动变化较大，对小杂质的检测有影响.

2.4 检测限和定量限的比较 在两种方法条件下，以信噪比为3∶1时相应浓度确定为检测限，信噪比为10∶1时确定为定量限，分别配制一定低浓度的甲苯比妥和苯巴比妥进行测试，结果EP7.1方法对甲苯比妥的检测限是0.005 0%，定量限是0.017%(相对于测试样)，苯巴比妥的检测限是0.002 7%，定量限是0.092%(相对于测试样).CEP方法对甲苯比妥的检测限是0.006 1%，定量限是0.021%(相对于测试样).从数据可知EP7.1的方法检测限和定量限都比CEP方法更好，其检测灵敏性更高.

2.5 两种标准样品测试比较 EP7.1方法主要控制杂质A(5－乙基 －2，6－二亚胺基 －5－苯基四氢嘧啶酮)(≤0.15%)和B(5－乙基－6－亚胺基－5－苯基二氢嘧啶二酮)(≤0.15%)，其余未指明杂质≤0.10%，总杂质≤0.20%;CEP注册方法控制巴比妥酸≤0.15%，甲苯比妥≤0.15%，其余未指明杂质≤0.10%，总杂质≤0.25%.在两种方法条件下，对本公司生产的10批进行检测，EP7.1方法能检测出杂质B，而CEP方法不能检出，且对样品中主要杂质甲苯比妥的检测，EP7.1方法能检测大于0.01%的效果，对巴比妥酸也能检测，其余未指明杂质EP7.1方法能检测出4个，CEP方法只能检测出2～3个，虽然CEP方法是为了控制起始原料的杂质，但在成品检测结果中未有起始原料的有关杂质，且一批样品的分析时间CEP比EP7.1方法长20 min.可见，EP7.1方法能更加有效检测控制苯巴比妥产品中的杂质，是一种更适用可行的检测方法.相关图谱见图1～6.

3 讨论

通过对苯巴比妥两种HPLC分析方法比较可以看出，EP7.1方法更加灵敏，对杂质的检查更加有效可行，且每批检测时间也缩短，提高了分析工作效率，本公司现已采用EP7.1方法进行日常检测，且在欧洲的注册也进行了分析方法变更申请.

图1 EP7.1方法检测杂质对照A和B

图2 EP7.1方法检测本公司注册标准对照

图3 EP7.1方法检测本公司样品

图4 CEP注册方法检测杂质对照A和B

图5 CEP注册方法的标准对照测试

图6 CEP注册方法测试本公司样品