蜜环菌菌粉中甘露醇测定方法的比较与优化

朱显峰，范书军，余晨晨，秦仁炳

(河南大学生命科学学院生物工程研究所，河南开封 475004)

蜜环菌菌粉中甘露醇测定方法的比较与优化

朱显峰，范书军，余晨晨，秦仁炳

(河南大学生命科学学院生物工程研究所，河南开封 475004)

目的:比较对蜜环菌菌粉的不同预处理方法和甘露醇含量测定方法，筛选更有效的方法对蜜环菌菌粉中甘露醇含量进行测定。方法:用醇提取、水提取和超声波破碎法对蜜环菌菌粉进行甘露醇提取比较，并选出最优者;使用浓盐酸与样品液共热去除果糖干扰;采用碘量法和分光光度法分别对蜜环菌菌粉进行甘露醇含量测定比较。结果:以水为溶剂，80℃下对蜜环菌菌粉进行超声波破碎，相对醇提取法和水提取法能有效提高甘露醇测定值;浓盐酸与样品液沸水共热可有效去除果糖干扰;在存在葡萄糖等单糖对甘露醇干扰的情况下，分光光度法测定值相对碘量法更准确。结论:以超声波破碎预处理、浓盐酸去除果糖干扰，采用分光光度法为具体测定方法的组合方式为最佳测定方法。

甘露醇，蜜环菌，超声波破碎法，分光光度法

蜜环菌(Amillariella mellea)，属于担子菌亚门白蘑科，与天麻共生，是一种药食两用真菌［1］。蜜环菌具有安眠、抗惊厥、治疗心脑血管疾病、增强免疫力等作用［2］。甘露醇是蜜环菌产品制剂的重要活性成分之一，具有利尿脱水、降低血黏度、改善微循环等作用［3］，其含量也成为蜜环菌产品的质量控制指标之一。因此，对蜜环菌产品制剂中甘露醇含量进行有效测定至关重要。目前，对蜜环菌菌粉等蜜环菌产品制剂主要采用有机溶剂加热回流进行预处理，对果糖等单糖的干扰因素往往未予考虑，造成测定结果误差偏大，测定甘露醇含量方法上以碘量法为主，难以实现快速测定［4］。本实验从蜜环菌菌粉制剂预处理、对样品液脱水处理去除干扰因素影响和蜜环菌中甘露醇含量测定方法三方面进行了研究，力求使测定方法更加准确、方便、快速、有效。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蜜环菌菌粉制剂 由河南龙都药业有限公司提供;高碘酸钠 华东师范大学化工厂，分析纯;L－鼠李糖、甘露醇、乙酸铵、乙酰丙酮 天津市化学试剂三厂，分析纯;冰醋酸、碘化钾、硫代硫酸钠、果糖、葡萄糖、浓盐酸、浓硫酸 天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯。

TU－1800紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;JYD－150智能型超声波细胞粉碎机 上海之信仪器有限公司;高效索氏提取器ST－80 北京赛福莱博科技有限公司;数显恒温水浴锅HH－8 常州国华电器有限公司。

表1 不同预处理方式的测定结果比较(mg/g)

1.2 实验方法

1.2.1 蜜环菌菌粉的预处理方法

1.2.1.1 水提取法 精确称取蜜环菌菌粉5份，每份0.5g，放入500mL三角瓶中，加蒸馏水250mL，80℃水浴提取1.5h，冷却，取提取液离心，取上清1mL适当稀释即为供试样品液。

1.2.1.2 醇提取法 精确称取蜜环菌菌粉5份，每份0.5g，用滤纸包好，并取同型滤纸作空白对照，将包好的菌粉及空白滤纸分别放入索氏提取器，加95%乙醇180mL，加热回流循环两次，待第三次剩余乙醇10%左右时，加蒸馏水20mL，继续蒸馏出残余乙醇，剩余液体移至250mL容量瓶，定容，取1mL适当稀释即得供试样品液。

1.2.1.3 超声波破碎法 精确称取蜜环菌菌粉5份，每份0.01g，置于10mL短试管中，加蒸馏水8mL，利用超声波细胞粉碎机破碎，功率260W，操作温度80℃，时间15min，冷却，将破碎液离心，取上清液1mL适当稀释即为供试样品液。

1.2.2 脱水处理方法 制备如下样品液∶甘露醇溶液(1g/L)，甘果混合液(甘露醇1g/L，果糖0.2g/L)，甘葡混合液(甘露醇1g/L，葡萄糖0.2g/L)，总混合液(甘露醇1g/L，果糖0.2g/L，葡萄糖0.2g/L)。取2mL样品液置具塞试管中，加3mL浓盐酸，沸水共热10min，冷却，适当稀释即为脱水处理供试样品液［5］;取2mL未经脱水处理的样品液，稀释相同倍数即为经脱水处理的供试样品液。

1.2.3 甘露醇含量测定方法

1.2.3.1 分光光度法 方法∶取1mL供试样品液置于具塞试管中，分别加入1mL高碘酸钠溶液(取高碘酸钠0.321g溶于100mL 0.12mol/L盐酸溶液中)混匀，室温下放置10min，加入0.1%L－鼠李糖溶液2mL，混匀后加入4mL新配制的Nash试剂(15g乙酸铵+ 0.2mL冰醋酸+0.2mL乙酰丙酮，定容至100mL)，混匀，在53℃恒温水浴中加热15min，放冷，以蒸馏水作空白对照，在413nm处测定吸光度［6］。

原理∶高碘酸钠与甘露醇反应生成黄色的3，5－二乙酰－1，4脱氢二甲基吡啶，该物质在413nm处有最大吸收峰，可测定出相应吸光度，并通过标准曲线对甘露醇进行计算。

标准曲线的制作∶精密量取甘露醇标准品溶液(1mg/mL)0.01、0.02mL依次至0.08mL，分别置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，再各取1mL分别置于具塞试管中，按照上述方法进行吸光度测定。按吸光度(X)对甘露醇(Y)含量作图，得回归方程∶Y=0.0952X+0.00306，r=0.99866。

1.2.3.2 碘量法［7］方法∶精确量取供试样品液4mL，置碘量瓶中，精确加入高碘酸钠溶液［浓硫酸溶液(1→20)90mL与高碘酸钠溶液(1→1000)110mL混合制成］50mL，置水浴上加热15min，放冷，加碘化钾试液5mL，密塞，摇匀，反应5min，用硫代硫酸钠滴定液(0.03mol/L)，滴定至浅黄色时，加淀粉指示剂1mL，继续滴定至蓝色消失，并将滴定结果用空白实验(不加供试样品液，仅高碘酸钠溶液参与反应)校正。每1mL硫代硫酸钠滴定液(0.03mol/L)相当于0.5465mg的甘露醇。

原理与计算∶甘露醇在酸性溶液中被高碘酸钠氧化生成碘酸钠，剩余的高碘酸钠以及反应生成的碘酸钠均可与碘化钾反应生成碘，利用标准硫代硫酸钠滴定液对碘滴定至终点，可得硫代硫酸钠滴定液的消耗量，记作V硫代硫酸钠(mL)，空白实验的滴定量记作V空白(mL)。

供试样品液中甘露醇含量(mg/mL)=(V空白－V硫代硫酸钠)× 0.5465/4

2 结果与讨论

2.1 不同预处理方法对测定结果的影响

按照上述方法分别以水提取法、醇提取法和超声波破碎法对菌粉进行预处理，并对测定结果进行比较，结果见表1。

对以上结果进行比较表明，超声波破碎法(平均值54.91mg/g，RSD 1.30%)预处理效果最好，水提取法(平均值42.77mg/g，RSD 1.46%)次之，醇提法(平均值25.81mg/g，RSD 2.78%)最差。

2.2 脱水处理对测定结果的影响

精确量取1.2.2中制备的脱水处理与未脱水处理供试样品液利用分光光度法进行测定，结果如图1所示。

未经脱水处理时，果糖对甘露醇测定的干扰较大，葡萄糖较小。经脱水处理后果糖干扰得到了有效降低，此时葡萄糖的干扰极小，处于甘露醇测定的误差范围以内，可以忽略不计。

2.3 分光光度法与碘量法的比较

2.3.1 对甘露醇混合液的测定结果比较 取1.2.2中制备的甘露醇溶液、总混合液以及脱水处理过的总混合液，分别利用分光光度法和碘量法进行含量测定，测定结果如表2所示。

表3 分光光度法和碘量法对蜜环菌菌粉中甘露醇含量测定的比较(mg/g)

图1 脱水处理对甘露醇测定的影响

表2 分光光度法和碘量法对甘露醇混合液中甘露醇含量测定的比较(g/L)

上述两种方法对纯甘露醇溶液中甘露醇含量的测定都有着很高的精确度，而对总混合液中甘露醇含量的测定，无论是否经过脱水处理，碘量法的测定结果都远偏离于真实值，而分光光度法则非常接近真实值。

2.3.2 对蜜环菌菌粉的测定结果比较 精确称取同一批次蜜环菌菌粉5份，经超声波破碎，浓盐酸脱水处理后，分别以分光光度法和碘量法进行测定，结果如表3所示。

经脱水处理后，蜜环菌菌粉中甘露醇含量的测定值较处理前(见表 1)有所下降，平均值由54.91mg/g降为 50.19mg/g。而碘量法的测定值(79.02mg/g)与分光光度法的测定值(50.19mg/g)相比，碘量法的测定值较大，参照2.3.1的测定结果，表明碘量法的测定值存在较大误差。

2.4 讨论

由于甘露醇在乙醇中的溶解度偏低，所以水提取法优于醇提取法，而超声波破碎法可使菌粉中的甘露醇得到更大程度的释放，比水提取法更有效地提高了测定值。使用浓盐酸与样品液沸水共热，使样品液中的果糖脱水生成糠醛，有效降低了果糖对测定结果的影响。在碘量法中，葡萄糖、甘露糖、果糖等单糖亦可与高碘酸反应，造成滴定结果偏大，对测定结果造成了较大干扰。在除去大部分果糖影响后，分光光度法相对碘量法更准确。

3 结论

以超声波破碎法对菌粉进行预处理，浓盐酸与样液共热除去果糖干扰，采用分光光度法进行具体测定的组合方式为有效测定蜜环菌菌粉制剂中甘露醇含量的最佳方法。

［1］卯晓岚.中国经济真菌［M］.北京:科学出版社，1998:133.

［2］宋成芝，徐燕.蜜环菌的化学成分及药理作用研究［J］.安徽农业科学，2010，38(10):5119－5120.

［3］山晓瑞.甘露醇的临床应用［J］.中国现代药物应用，2008，2(9):52－53.

［4］殷永伟，王玉霞，耿琴.高碘酸钠法测定晕痛定胶囊中甘露醇的含量［J］.数理医药学杂志，2009，22(4):477－478.

［5］蒋华，陈卫，赵建新，等.分光光度法测定乳酸菌发酵体系中甘露醇的含量［J］.食品与发酵工业，2005，31(4):105－107.

［6］李雪芹，包天桐，王雁，等.比色法测定冬虫夏草中甘露醇的含量［J］.中草药，1999，30(1):19－21.

［7］国家药典委员会.中华人民共和国药典二部［S］.北京:化学工业出版社，2005: 72.

Comparison and optimization of the method to determine the content of mannitol in Amillariella mellea powder

ZHU Xian－feng，FAN Shu－jun，YU Chen－chen，QIN Ren－bing
(Institute of Bioengineering and College of Life Science，Henan University，Kaifeng 475004，China)

Objective:To establish a method to quickly extract and determinate the mannitol from the Amillariella mellea powder.Methods:The experimentation were studied from three aspects:the first is to choose an effective method of extraction，the second is to eliminate the interference from frucdose and the third is to choose an accurate mannitol determination method between the iodometric method and the colorimetric method.Results:The ultrasonic wave breaking method which choose water as the solution and set the operating teperature in 80℃ is more effective than water extraction method and ethanol extraction method.When 3mL concentrated hydrochloric acid and 2mL sample solution boiled together in 10min，the most interference from frucdose can be eliminated，and the colorimetric method is more accurate than the iodometric method.Conclusion:When the interference of frucdose has been eliminated，the best way to extract and determinate the mannitol in Amillariella mellea powder is the combination of the ultrasonic wave breaking method and the colorimetric method.

mannitol;Amillariella mellea;ultrasonic wave breaking method;colorimetric method

TS207.3

A

1002－0306(2011)11－0454－03

2010－10－11

朱显峰(1973－)，男，博士，副教授，主要从事微生物与生化药学的研究。

河南省科技攻关计划项目(102102310016)。