瓠瓜胰蛋白酶抑制剂的提取

马 勇，王国洋，张丽娜

(渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州 121000)

瓠瓜胰蛋白酶抑制剂的提取

马 勇，王国洋，张丽娜

(渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州 121000)

采用水提法从瓠瓜中提取胰蛋白酶抑制剂，以瓠瓜提取液对胰蛋白酶的抑制率为指标，研究了提取温度、液料比、提取时间、pH四个主要影响因素，优化选出最佳提取方案。从瓠瓜中提取胰蛋白酶抑制剂的最佳条件为:温度70℃、pH=8、液料比4∶1(mL/g)、提取时间1h。

瓠瓜，胰蛋白酶抑制剂，提取

胰蛋白酶抑制剂(trypsin inhibitor，TI)是一种重要的生化药物和生化试剂，广泛存在于动、植物和微生物中，泛指具有胰蛋白酶抑制作用的多肽或蛋白质，能与相应的蛋白水解酶形成一定的动态平衡，调节生物体内许多重要的生命活动［1－2］。根据其来源不同可分为多种，如从牛肺或牛胰中提取的抑肽酶(aprotinin)、从人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂(urinary trypsin inhibitor，UTI)、从大豆中提取的大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor，SBTI)等。食物中的植物胰蛋白酶抑制剂如果没有被除去或抑制，它在体内能与小肠液中胰蛋白酶、糜蛋白酶结合，生成无活性复合物，消耗和降解胰蛋白酶，导致肠道对蛋白质消化、吸收及利用能力下降，导致胰腺肿大和体内氨基酸代谢失调等疾病。但也有报导大豆中微量胰蛋白酶抑制剂对于糖尿病治疗、调节胰岛素失调有一定效果［3－4］。瓠瓜为葫芦科葫芦属植物瓠瓜的果实，具有清热利水、止渴、解毒功效，适应于治疗水肿腹胀、烦热口渴、肺炎、肠炎、糖尿病等症。瓠瓜含有蛋白质及多种微量元素，有助于增强机体免疫功能。同时，瓠瓜中含有丰富的维生素C，能促进抗体的合成，提高机体抗病毒能力。瓠瓜中存在胰蛋白酶抑制剂，对胰蛋白酶有抑制作用，从而具有降血糖的效果。本实验通过单因素实验和正交实验确定胰蛋白酶抑制剂活性成分的最佳提取条件。对瓠瓜蛋白酶抑制剂的深入研究和应用具有推动作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胰蛋白酶 北京奥博星生物技术责任有限公司; BAPNA sigma;二甲亚砜 国药集团化学试剂有限公司;3－羟甲基－氨基甲烷、无水氯化钙、盐酸、三氯乙酸、氢氧化钠 国产分析纯;新鲜瓠瓜 锦州闾山产。

UV－1900双光束紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;RE52－86A旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂;PB－10酸度计 北京赛多利斯仪器系统有限公司;HH－501超级恒温水浴 金坛市科析仪器有限公司;FA2004电子分析天平 上海恒平科学仪器有限公司;TD5A－WS型离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 测定方法 以瓠瓜提取液对胰蛋白酶的抑制率为指标，研究瓠瓜中胰蛋白酶抑制剂的最佳提取条件。瓠瓜中胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制率测定［5］，采用 BAPNA法。取1mL样品提取液，加1mL蒸馏水，加入5mL BAPNA溶液，于37℃恒温10min后，立即加入1mL 30%三氯乙酸终止反应，在410nm波长处测定吸光度［6］。从而计算出抑制率。抑制率公式∶

式中∶η－样品提取液对胰蛋白酶的抑制率; A0－胰蛋白酶溶液的吸光度;Ai－样品溶液的吸光度; Ab－样品溶液对照空白的吸光度。

1.2.2 提取工艺 瓠瓜经去皮捣碎后，得到瓠瓜样品，取20g处理后的瓠瓜样品，按一定的液料比，加入蒸馏水，在一定的温度下提取一段时间后，对提取液进行抽滤，减压浓缩到一定体积(≤50℃)，3500r/ min离心15min，定容至刻度，即得样品待测液，按1.2.1的方法进行测定。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

图1 温度对抑制率的影响

2.1.1 温度对抑制率的影响 取20g样品加150mL蒸馏水，调节pH=7，分别在50、60、70、80、90、100℃水浴中提取1h，抽滤，减压浓缩(≤50℃)到20mL，离心，测定抑制率。由图1结果可以看出，随着温度的升高，抑制率有增大的趋势，当温度达到70℃时抑制率最大;之后，温度继续升高，抑制率则有所下降。这可能是由于温度过高影响了瓠瓜胰蛋白酶抑制剂的活性。因此，提取温度在70℃左右为宜。

2.1.2 pH对抑制率的影响 取20g样品加150mL

蒸馏水，分别调pH为3、5、7、9和11，在70℃水浴中提取1h，抽滤，减压浓缩(≤50℃)到20mL，离心，测定抑制率。

图2 pH对抑制率的影响

由图2结果可以看出，在pH小于7时，随pH的增大抑制率逐渐增大;在pH达到7后随pH的增大，抑制率开始降低。说明在中性条件下瓠瓜胰蛋白酶抑制剂抑制效果最好。

2.1.3 液料比对抑制率的影响 取20g样品分别加40、80、120、160、200mL蒸馏水，调节pH=7，在70℃水浴中提取1h，抽滤，减压浓缩(≤50℃)到20mL，离心，测定抑制率。

由图3结果可以看出，随着液料比的增大，抑制率增大，在液料比达到6∶1后，抑制率不再增大。说明瓠瓜胰蛋白酶抑制剂已经充分溶解到水溶液中。

2.1.4 提取时间对抑制率的影响 取20g样品加120mL蒸馏水，调节pH=7，在70℃水浴中分别提取0.5、1、2、3、4h，抽滤，减压浓缩(≤50℃)到20mL，离心，测定抑制率。

图3 液料比对抑制率的影响

图4 提取时间对抑制率的影响

由图4结果可以看出，随着提取时间的延长，抑制率不断增大，提取1h后抑制率变化幅度减小，提取2h后抑制率不再增大。说明2h可以将瓠瓜胰蛋白酶抑制剂基本提取完全。考虑到实验条件及成本等问题，采取的提取时间为1h。

2.2 正交实验

在单因素实验的基础上，选用L9(33)正交实验进行优化，以此确定瓠瓜胰蛋白酶抑制剂的最佳提取条件，见表2(正交因素水平见表1)。

表1 正交因素水平

表2 正交实验方案及结果

分析结果表明∶三种考察因素对胰蛋白酶抑制剂抑制率的影响顺序为B＞C＞A，即pH对实验结果影响最大，液料比的影响次之，提取温度的影响稍小。由K值可以得出影响因素最佳组合为A2B3C1，即提取温度为70℃，pH为8，液料体积比为4∶1。当提取时间为1h时，A2B3C1组合的抑制率为76.45%。

3 结论

3.1 从瓠瓜中提取胰蛋白酶抑制剂的最佳条件为∶温度为70℃，pH为8，液料比为4∶1，提取时间1h。

3.2 瓠瓜中的胰蛋白酶抑制剂比较耐高温，在70℃后抑制率开始下降，但仍具有较高的抑制率，在100℃时仍有活性，具有较好的热稳定性［7－9］。

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Extraction of trypsin inhibitor in gourd

MA Yong，WANG Guo－yang，ZHANG Li－na

(College of Biotech and Food Science，Bohai University，Jinzhou 121000，China)

The trypsin inhibitor in gourd was obtained by a water－extracting method.The extraction temperature，liquid/material ratio，extraction time and pH value were considered as four important factors to determine the optimal extraction factors，with the inhibition of gourd extracts on trypsin as the reference.The optimal extraction conditions were proved to be with liquid/material ratio(mL/g)4∶1，extraction time 1 hour at 70℃ and pH=8.

gourd;trypsin inhibitor;extraction

TS201.2+5

B

1002－0306(2011)11－0299－03

2010－12－06

马勇(1960－)，男，博士，教授，研究方向:食品检验与食品开发。