人α-乳白蛋白在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

张莉，李庆章，田雷，崔英俊，赵冰，吕英，高学军，姜毓君

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）

人α-乳白蛋白在奶牛乳腺上皮细胞中的表达

张莉，李庆章，田雷，崔英俊，赵冰，吕英，高学军，姜毓君

（东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨150030）

将人α-乳白蛋白（α-LA）0.76 kb的cDNA序列连接到PSV载体SV40启动子后，构建真核表达载体hα-LA–psv。将构建的真核表达载体转染奶牛乳腺上皮细胞，人α-乳白蛋白的表达量约为0.85 g/L。结果表明，构建的真核表达载体能够在体外培养的牛乳腺上皮细胞中高效表达人α-乳白蛋白。

人α-LA；基因表达；奶牛乳腺上皮细胞

0 引言

牛乳和人乳在组成上是有差别的，人乳蛋白主要是乳清蛋白，约占总蛋白的70%，其他的为酪蛋白，而牛乳蛋白主要是酪蛋白，约占总蛋白的78.8%，乳清蛋白含量低，所以改良牛乳的蛋白组成和含量，使之更接近于人乳，会提高牛乳的营养价值[1]。α-乳白蛋白是一种主要的乳清蛋白，具有调节产乳的功能[2]，还有细胞溶解活性[3]、诱导细胞生长抑制和细胞凋亡[4]等多种功能。使用基因重组技术在细胞和转基因动物中表达α-乳白蛋白的研究目前只是在小鼠、大鼠和猪体内进行，在反刍动物中还未见报道。本研究是在奶牛乳腺上皮细胞中进行人α-乳白蛋白的表达研究，为以后制备转基因牛乳腺反应器，生产含人α-乳白蛋白的转基因牛奶，进行前期基础研究。

1 实验

1.1 材料

hα-LA-cDNA-T菌株与初步培养的奶牛乳腺上皮细胞（来自本实验室），菌株JM109，pGEM-T载体，pSV-Galactosidase Control载体，TfxTM-20真核转染试剂，限制性内切酶，T4 DNA连接酶，胶回收试剂盒，去内毒素质粒提取试剂盒，F12培养基，角蛋白18抗体，鼠抗人alpha lactalbumin单克隆抗体（IgM），辣根过氧化物酶标记兔抗鼠IgM二抗，ECL发光液。

1.2 方法

1.2.1 表达载体的构建及鉴定

大量提取hα-LA-cDNA-T质粒和pSV载体质粒，将它们用PstI和AgeI 37℃水浴双酶切3 h后，分别纯化回收0.76 kb的人α-乳白蛋白和3.55 kb的pSV黏性末端片段。将两个片段用T4 DNA连接酶22℃水浴连接4 h后，转化JM109感受态细菌，挑选阳性克隆，摇菌扩增后提取质粒，进行双酶切鉴定。将经双酶切鉴定的阳性重组子命名为hα-LA–psv，质粒于-20℃保存备用，并于-70℃保存菌种。

1.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的培养、纯化和鉴定

初步培养的奶牛乳腺上皮细胞，加入质量分数为15%DF12完全培养液，于CO2培养箱中37℃培养。根据上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶消化敏感性不同，在混合生长的细胞培养物中，用质量分数为0.25%胰蛋白酶37℃消化，待成纤维细胞细胞质回缩，脱离瓶壁时，终止消化，将酶液倾出，换完全培养液，经2～3次如此选择传代后，即可得到纯化的牛乳腺上皮细胞。应用免疫荧光细胞染色法，使用激光共聚焦显微镜对纯化后的牛乳腺上皮细胞角蛋白18的表达进行检测。

1.2.3 细胞转染

将纯化的奶牛乳腺上皮细胞以2×104/cm2的浓度接种12孔培养板，待细胞80%连生时，按照TfxTM-20说明书上的方法将重组质粒hα-LA-psv转染牛乳腺上皮细胞。

1.2.4 人α-乳白蛋白的Western Blot检测

将转染72 h的细胞，小心倾去培养液，加入裂解液裂解15 min后，再加入等量的2×SDS上样缓冲液备用。SDS-PAGE电泳后，切取11～17 ku之间的部分，20V转膜17 min，5%的脱脂奶粉封闭1h，按1∶600比例加入一抗，室温混匀后，4℃过夜；TBST洗膜3次（每次5 min），按1∶2000的比例加入二抗，37℃作用1 h，TBST洗膜3次（每次6 min），加入ECL发光液作用2～3 min，曝光1～3 min，显影30～50 s，水洗后，定影。扫描仪扫描结果后，Image-Pro Plus 5.0分析蛋白区带，估算蛋白表达量。同时切取34～43 ku之间部分做GAPDH内参（36 ku），20 V转膜50 min，检测。

2 结果

2.1 真核表达载体的构建及鉴定

将提取的PSV质粒用AgeI和PstI大量双酶切，将切去质粒SV40启动子后的β-半乳糖苷酶基因全部片断余下的3.55 kb的黏性末端片段胶回收纯化。纯化后的片段与hα-LA-cDNA-T质粒用AgeI和PstI大量双酶切纯化后的0.76 kb的人α-乳白蛋白黏性末端片段进行连接，得到真核表达载体hα-LA–psv。双酶切鉴定结果，分别对应于hα-LA-cDNA和PSV（去β-半乳糖苷酶基因全部片断）的大小，与预期结果一致，如图1所示，证实hα-LA-cDNA序列与PSV载体成功重组。

图1 重组子hα-LA-psv的双酶切鉴定图谱

2.2 奶牛乳腺上皮细胞的纯化和鉴定

纯化培养的牛乳腺上皮细胞（图2（a）），用免疫荧光细胞染色法检测角蛋白18的表达，使用激光共聚焦显微镜观察染色结果（图2（b）），同时用本实验室纯化的成纤维细胞作阴性对照（图2（c））。图中红色的为PI标记的细胞核，绿色的为FITC标记的角蛋白18，结果说明得到的细胞是乳腺上皮细胞。

图2 奶牛乳腺上皮细胞的纯化和鉴定

2.3 细胞转染及表达产物的检测

转染72 h的牛乳腺上皮细胞裂解液，用Western Blot方法检测到了人α-乳白蛋白表达，扫描仪扫描结果后（图3），用Image-Pro Plus 5.0分析蛋白区带，估算得转染72 h的细胞中人α-乳白蛋白的表达量约为0.85 g/L。

图3 转染72 h人α-LA基因表达检测

3 讨论

利用转基因技术改善乳成分，在通过牛乳生产人乳中的一些成分改善牛乳品质方面被认为有抑菌、杀菌作用和有助于婴儿铁的更新及铁向黏膜细胞转运的人乳铁蛋白转基因牛已经研究成功，荷兰Gen Pharm公司用转基因牛生产人乳铁蛋白，预计每年从乳中提炼出营养奶粉的价值为50亿美元[5]。α-乳白蛋白被认为是乳糖合成酶的一个亚基，控制着乳中乳糖的含量，理论上如果乳腺能够合成更多的乳糖，产乳的体积也会有相应比例的增加。因此，增加乳中α-乳白蛋白的含量很有价值。目前已有研究将牛α-乳白蛋白基因在转基因猪和转基因小鼠中进行了表达，结果均引起了乳产量的增加[6，7]。另外，乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳汁的特殊功能，是制作乳腺生物反应器的靶细胞，因此可以利用体外培养的、能合成和分泌乳蛋白的乳腺上皮细胞来检测特异性表达载体的功能，具有方便、快捷且真实反映乳腺在体内表达水平的功能[8]。本实验在纯化鉴定的稳定的奶牛乳腺上皮细胞中，进行了人α-乳白蛋白基因的表达研究，结果产生了具有活性的人α-乳白蛋白，为以后在牛乳中生产人α-乳白蛋白，增加乳中乳糖的含量和乳产量，提高牛奶的营养价值，进行了准备研究。试验结果表明培养纯化的牛乳腺上皮细胞能够很好的表达外源基因，可进行相关的表达研究，可为以后制备乳腺生物反应器、研究泌乳机制及泌乳调控机制提供基础。

[1] 汪玉松,邹思湘.乳生物化学[M].长春：吉林大学出版社,1995.

[2] 刘思国,魏影允,胡国法,等.人α-乳白蛋白在转基因小鼠乳汁中动态表达图貌[J].中国科学：C缉,2003,33(4):317-322.

[3] MCKENZIE H A,WHITE F H,STINNAKRE M G,et al.Studies on a Trace Cell Lytic Activity Associated with Alpha-Lactalbumin[J].Biochem Int,1987,14(2):347-356.

[4] HAKANSSON A,ZHIVOTOVSKY B,ORRENIUS S,et al.Apoptosis Induced by a Human Milk Protein[J].Proc Natl Acad Sci USA,1995,92(17):8064-8068.

[5] VAN,WELLING M M,GEERTS M,et al.Large Scale Production of Recombinant Human Lactoferrin in the Milk of Transgenic Cows[J].Nat Biotechnol,2002,20(5):484-487.

[6] BLECK G T,WHITE B R,MILLER D J,et al.Production of Bovine Alpha-lactalbumin in the Milk of Transgenic Pigs[J].J Anim Sci,1998,76(12):3072-3078.

[7] BOSTON W S,BLECK G T,CONROY J C,et al.Short Communication:Effects of Increased Expression of Alpha-lactalbumin in Transgenic Mice on Milk Yield and Pup Growth[J].J Dairy Sci,2001,84(3):620-622.

[8] XU M N,LI S G,ZHAO J Y,et al.The Detection Method of Mammary Gland Bioreactor Expression Vector[J].Biotechnol Bull,2003,5:23-26.

Construction of human alpha lactalbumin expression vector and its expression in bovine mammary epithelial cells

ZHANG Li，LI Qing-zhang，TIAN Lei，CUI Ying-jun，ZHAO Bing，LV Ying，
GAO Xue-jun，JIANG Yu-jun
（Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China）

The expression vector hα-LA–psv including human alpha lactalbumin 0.76 kb cDNA gene sequence was successfully constructed and transfected into the bovine mammary epithelial cells.The production of human alpha lactalbumin was 0.85mg/mL approximately.The results indicate that the expression vector can express alpha lactalbumin in bovine mammary epithelial cells effectively.

human α-LA；gene expression；bovine mammary epithelial cells

TS252.1

A

1001-2230（2011）02-0004-02

2010-10-15

黑龙江省教育厅科学技术研究项目(No.11511027)；黑龙江省博士后基金(LBH-Z09270)；东北农业大学博士科研启动基金(190106)资助。

张莉（1978-），女，副教授，主要研究方向为泌乳生物学与乳腺功能调控。