酶解对牛乳酪蛋白抗原性的影响

刘晓宇，李铮，张颖，布冠好，罗永康

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

酶解对牛乳酪蛋白抗原性的影响

刘晓宇，李铮，张颖，布冠好，罗永康

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

采用5种常用酶对酪蛋白进行酶解，用间接竞争性ELISA方法测定酪蛋白水解物的残留抗原性。结果表明，采用酶解的方法能够有效降低酪蛋白的抗原性，但是不能够将抗原表位完全除去，酶解产物仍保留有一部分抗原性。不同的酶降低酪蛋白抗原性的程度不同，碱性蛋白酶降低酪蛋白抗原性的效果最佳，但是酶解物苦味较重，木瓜蛋白酶既能有效降低酪蛋白的抗原性，酶解物又具有较好风味。

酪蛋白；酶解；抗原性；ELISA

0 引言

牛乳中的酪蛋白具有高度的致敏性，它由αs1-酪蛋白，αs2-酪蛋白,β-酪蛋白,κ-酪蛋白组成,以大约40%，10%，40%，10%的比例聚合成微粒并悬浮于乳清中[1]。Bernard[1]采用58个孩子（平均年龄11个月）的血清分别与4种酪蛋白进行抗原抗体反应，结果发现85%的孩子对4种酪蛋白都存在特异性IgE，其中大部分是针对αs1-CN和β-CN的特异性IgE。Docena[2]采用80个对牛乳过敏的病人的血清进行实验，结果发现80/80的病人的血清中都存在针对酪蛋白的特异性IgE，这表明酪蛋白是牛乳中主要的过敏原之一。

目前，国内外对降低酪蛋白抗原性的研究较少：Prakash[3]用中性蛋白酶酶解酪蛋白，结果发现当水解度为5%时，抗原性降低了70%～80%;Wróblewska,B[4]采用双酶分步水解法将酪蛋白进行水解，将水解物按照分子量大小进行分离，测定不同分子量片段的抗原性，结果发现分子量越小，抗原性越低；Wróblewska,B.[5]采用碱性蛋白酶,胃蛋白酶，乳糖酶对酪蛋白进行多酶分步酶解，结果发现多酶分步酶解并不能降低乳请蛋白和酪蛋白的抗原性。

目前对酶解能否有效降低酪蛋白抗原性还未定论，本文采用5种常用酶在同一酶解模式下对牛乳酪蛋白进行酶解，研究酶解对酪蛋白抗原性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要原材料

酪蛋白，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶（0458）；风味蛋白酶；碱性蛋白酶（2709），中性蛋白酶（1398），α-酪蛋白（α-CN，C-6780），β-酪蛋白(β-CN，C-6905)，牛血清白蛋白(BSA)，HRP标记的羊抗兔IgG（A 6154，效价1︰10000），TNBS（P-2297）。

1.1.2 仪器与设备

96孔酶标板（3590），大龙移液枪（多种规格），Thermo Multiskan MK3酶标仪，分析天平（AY220），冷冻离心机（TGL-16A），PH计（FE20），UV-2600紫外可见分光光度计，电热恒温水浴锅(W201)，漩涡混合器（XW-80A）。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶酶活力的测定

采用福林-酚试剂法[6]。

1.2.2 蛋白质水解度的测定

采用三硝基苯磺酸法(Trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS)[7，8]。

取0.25 mL的样品(1 L中含有的氨基量0.25×10-3～2.5×10-3之间)与2 mL磷酸缓冲溶液和2 mL的0.1%的TNBS溶液混合，接着在50℃的暗室中放置60 min，反应完毕之后，用4 mL浓度为0.1 moL/L的HCl终止反应，接着在室温下放置30 min，于420 nm下测其吸光值。浓度为0～2.5×10-3moL/L的L-亮氨酸作标准曲线。水解度为

DH%=(AN2×F2-AN1×F1)/htot×100%，

式中：AN2为水解样品中每克蛋白含有的氨基浓度（mmoL/g）；F2为水解样品的稀释倍数；AN1为未水解样品中每克蛋白含有的氨基浓度（mmoL/g）；F1为未水解样品的稀释倍数；htot为每克原料蛋白质的总的肽键毫摩尔数，酪蛋白的htot为8.3 mmoL/g。

1.2.3 酪蛋白水解物抗原性的测定

采用间接竞争抑制ELISA方法[9，10]。

(1)抗原包被。用包被液稀释抗原(α-酪蛋白或β-酪蛋白)，100 μL/孔加入酶标板中，4℃过夜。

(2)抗原与初级抗体反应。在反应管中加入一定量抗原(α-酪蛋白或β-酪蛋白)或待测样品和一定量稀释的兔血清，不加抗原或样品的反应管作为无竞争反应体系，4℃冰箱中过夜。

(3)洗涤。次日倾去孔内的液体，用250 μL/孔清洗液4次洗板，甩干。

(4)封闭。加封闭液进行封闭，每孔100 μL，37℃放置1 h。

(5)加样。将步骤(2)中的混合物以100 μL/孔的量加入(1)酶标板内，于37℃温育1 h。

(6)洗涤。用洗涤液洗板4次，甩干。

(7)加酶标二抗。用封闭液将HRP-羊抗兔IgG稀释，加入100 μL/孔，37℃温育1 h。

(8)洗涤。用清洗液洗4次，甩干。

(9)显色。加新鲜配制的TMB底物溶液100 μL/孔,37℃暗处反应10 min显示蓝色。

(10)终止反应。加50 μL/孔终止液以终止反应，颜色变黄。

(11)比色。用酶联免疫检测仪双波长测定各孔的吸光值。

(12)数据处理。被测物残留的抗原性大小可用其抗原抑制率来评价，按下式计算：

抗原抑制率=(B0-B)/B0×l00%，

式中：B为被测样的A值；B0为无竞争体系的A值。

抗原抑制率表征酶解样品中α-酪蛋白(或β-酪蛋白)抑制抗血清与酶标板上包被的α-酪蛋白(或β-酪蛋白)结合的能力的大小，记为α-酪蛋白抗原抑制率(或β-酪蛋白抗原抑制率)。

抗原抑制率大则表明酶解样品中的残留抗原能够较强地抑制抗血清与酶标板上的抗原结合，间接表明酶解样品中的残留抗原较多；抗原抑制率小则表明酶解样品中的残留抗原抑制抗血清与酶标板上抗原结合的能力小，间接表明酶解样品中的残留抗原少。

抗原抑制率与被测物的抗原量成正比,抗原抑制率越高，被测物的抗原量越高，抗原抑制率越低，被测物的抗原量越低。

1.2.4 苦味值的测定

感官评定小组由经过筛选的6人组成(均为不吸烟者)，评定员用蒸馏水漱口后，取酶解液2.0 mL左右置于口中，5～10 s后吐出。然后根据表1的评分基准进行评分，评分值就是苦味值，得出的平均值表示酪蛋白肽的苦味程度[11，12]。

表1 苦味值的评分标准

1.2.5 蛋白酶水解酪蛋白工艺

称取一定量的酪蛋白，用浓度为0.067 mmol/L磷酸盐缓冲液按质量浓度为5 g/100 mL在

50℃加热条件下搅拌15 min使酪蛋白溶解，降至所需要的温度，然后加入酶并在其最适反应条件下进行水解(见表2)，酶添加量为1︰100（质量比），水解在恒温水浴锅中进行，水解时间6 h，分别于0 min，15 min，30 min，1 h，2 h，3 h，4 h，5 h，6 h取样，并将样品快速置于沸水中灭活10 min，用于测定水解物在各时间点的水解度和抗原性。

表2 水解用酶的酶解条件

2 结果与讨论

2.1 酶活力测定

酶活力单位定义：在40℃条件下每分钟水解酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量定义为一个酶活力单位。本研究测定了碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和胰蛋白酶5种酶的酶活，结果如表3所示。

2.2 水解度的测定

底物质量浓度为5 g/100 mL，酶与底物的比例(E︰S)为1︰100（质量比），在表1所示各酶的最适反应条件下进行水解，水解度随时间的变化结果如图1所示。

表3 蛋白酶的酶活力测定结果

由图1可以看出,这5种酶酶解物的水解度变化趋势相似，均是在反应刚开始时，水解度增加较快，随着反应时间的延长，水解度变化趋势趋于平缓，在当反应时间达到2 h后，再增加反应时间，水解度增大趋势不明显。因此，在进行优化设计时选择2 h的水解时间比较合适；碱性蛋白酶水解度较高，在酶解解6 h时，水解度达到9.8%，其次是木瓜蛋白酶，在酶解6 h时，水解度达到8.6%，依次为胰蛋白酶，中性蛋白酶，风味蛋白酶，酶解6 h时的水解度分别为8.2%，7.5%，7.1%。

图1 酪蛋白的酶解曲线

2.3 酶解对酪蛋白抗原性的影响

2.3.1 酶解过程对α-酪蛋白抗原性的影响

图2为酪蛋白水解过程中α-酪蛋白抗原抑制率的变化。由图2可以看出,木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解产物的α-酪蛋白抗原抑制率在前30 min内急剧降低，此后降低速度变缓，说明在此阶段内α-酪蛋白的大量抗原表位被破坏；碱性蛋白酶和中性蛋白酶的酶解产物的α-酪蛋白抗原抑制率在1 h内下降很迅速，但此后下降速度也变缓慢；风味蛋白酶的酶解产物的α-酪蛋白抗原抑制率一直呈缓慢下降趋势;水解2 h后，5种酶的酶解产物的α-酪蛋白抗原抑制率几乎不再下降或降低的速度极其缓慢;碱性蛋白酶，胰蛋白酶和木瓜蛋白酶降低α-酪蛋白抗原性的效果较好，在水解6 h后，3种酶的酶解产物的α-酪蛋白抗原抑制率依次为16.2%，21%，24%；中性蛋白酶效果次之，在水解6 h后，其酶解产物的α-酪蛋白抗原抑制率为28%,比原来降低了72%,这与Prakash[7]的研究结果相似；风味蛋白酶效果相对最差，在水解6 h后，其酶解产物的α-酪蛋白抗原抑制率为51%。

由此可见，碱性蛋白酶是降低酪蛋白α-酪蛋白抗原性的效果最好的蛋白酶，然后依次为胰蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，风味蛋白酶。

2.3.2 酶解过程对β-酪蛋白抗原性的影响

图2 α-酪蛋白抗原抑制率的变化

图3为酪蛋白水解过程中β-酪蛋白抗原抑制率的变化。由图3可以看出，碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的酶解产物的β-酪蛋白抗原抑制率在前30 min内急剧降低，此后降低速度变缓，中性蛋白酶和风味蛋白酶的酶解产物的β-酪蛋白抗原抑制率一直呈缓慢下降趋势；水解2 h后，5种酶的酶解产物的β-酪蛋白抗原抑制率降低的速度变缓慢；碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶降低β-酪蛋白抗原性的效果较好，在水解6 h后，2种酶的酶解产物的β-酪蛋白抗原抑制率依次为25%和34%；中性蛋白酶效果次之，在水解6 h后，其酶解产物的β-酪蛋白抗原抑制率为39%；胰蛋白酶和风味蛋白酶效果相对差，在水解6 h后，其酶解产物的β－酪蛋白抗原抑制率为50%和48%。

图3 β-酪蛋白抗原抑制率的变化

由此可见，碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶是降低酪蛋白β-酪蛋白抗原性的效果最好的蛋白酶，然后依次为中性蛋白酶、胰蛋白酶和风味蛋白酶。

2.4 酶解物的苦味值

当水解进行2 h后，酶解产物的水解度几乎不再变化。本研究对5种蛋白酶酶解2 h时的酶解产物进行了苦味评价。

通过1.2.5中的方法对5种酪蛋白水解物进行苦味评价，结果如表4所示。由表4可以看出，胰蛋白酶酶解产物的苦味值最高，然后依次为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和风味蛋白酶。木瓜蛋白酶酶解产物的苦味值最低。

表4 蛋白酶水解物的苦味值

3 结论

（1）酶解能够有效地降低牛奶中α-酪蛋白和β-酪蛋白的抗原性；

（2）不同的酶降低牛乳酪蛋白抗原性的效果不同，碱性蛋白酶降低酪蛋白抗原性的效果最好，其次是木瓜蛋白酶，然后依次为中性蛋白酶，胰蛋白酶，风味蛋白酶；

（3）以酶解产物的残留抗原性为主要指标，同时以苦味值为次要指标，通过综合评价，木瓜蛋白酶既能有效降低酪蛋白的抗

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Effect of enzymatic hydrolysis on the antigenicity of milk casein

LIU Xiao-yu,LI Zheng,ZHANG Ying,BU Guan-hao,LUO Yong-kang
(Food Science and Nutritional Engineering College，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Effect of enzymatic hydrolysis on the antigenicity of milk casein was investigated in this paper.Casein from milk was hydrolysed with 5 common proteases in the same scheme,then the residual antigenicity of the hydrolysate was estimated by indirect competitive ELASA method.The results indicated that it could reduce the antigenicity of milk casein effectively by enzymatic hydrolysis but could not get rid of the antigenicity absolutely,the hydrolysate still remained parts of allergenic activities.Different proteases had different effects on casein allergens.Alcalase was observed to be the most effective to reduce the allergenicity of milk casein,but it caused more bitterness.Papain could not only reduce the allergenecity of casein but also caused less bitterness.

casein；enzymatic hydrolysis；antigenicity；ELISA

Q935

A

1001-2230（2011）02-0027-04

2010-08-05

国家自然科学基金（30871817）。

刘晓宇（1986－），女，硕士研究生，从事乳品科学方面的研究。通讯作者：罗永康