2010年能力验证盲样样品细菌内毒素检查方法的建立

北京市海淀区药品检验所（100083）杨帆

本研究参照《中国药典》2005年版第二部中“细菌内毒素检查法”试验的基本原理和细菌内毒素检查干扰/确证试验的设计[1][2]，建立细菌内毒素检查的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 盲样冻干粉（70-A；70-B；70-C）。细菌内毒素工作标准品批号：150601-200862，规格：120 EU/ml，由中国药品生物制品检定所提供。鲎试剂批号：0904230，装量：0.1ml/支，灵敏度：0.25EU/ml，由湛江博康海洋生物有限公司提供。细菌内毒素检查用水（BET水）批号：090511，装量：2ml/支，由湛江博康海洋生物有限公司提供。ZH-Z型自动旋涡混合器，由天津市天大天发科技有限公司提供。HHSIINII型电热恒温水浴箱，由上海跃进医疗器械厂提供。

1.2 细菌内毒素理论限值（L）的计算 样品在实验前需用1ml细菌内毒素检查用水复溶，3份样品根据能力验证计划作业指导书设定的细菌内毒素限值均为“应小于50EU/ml。

1.3 鲎试剂灵敏度（λ）复核试验 按照《中国药典》2010年版二部附录ⅪE细菌内毒素灵敏度复核项下进行试验[1]，结果所用鲎试剂灵敏度均在0.5～2.0λ范围内，符合规定，可用于本试验。

1.4 干扰试验 最大有效稀释倍数（MVD）的计算。盲样样品的内毒素限度值设定L＝50EU/ml，且浓度为1ml/ml，对应于灵敏度λ=0.25 EU/ml的鲎试剂，注射用环磷腺苷内毒素检测最低有效稀释倍数为MVD=c×L/λ=200。

1.5 供试品的细菌内毒素检查试验 根据干扰试验结果，选择200倍稀释后的供试品液试验。然后用λ=0.25EU/ml的鲎试剂试验，并设供试品阳性对照（2λ）、阴性对照和阳性对照（2λ）。再取λ=0.25EU/ml的鲎试剂16支，分别用0.1 ml BET水溶解，再加入配制好的供试品稀释液0.1ml，每种药液平行做2管，37℃保温，60min后观察结果。

2 试验结果

2.1 鲎试剂灵敏度（λ）复核试验 试验结果表明，复核灵敏度λc=λ，鲎试剂灵敏度标示符合规定。见附表1。

附表1 鲎试剂标示灵敏度复核试验

2.2 干扰试验结果 各浓度对鲎试剂均无干扰，因其理论稀释倍数为200倍，所以确定供试品浓度0.25EU/ml为最终有效稀释浓度。见附表2。MVD=c×L/λ=1×50/0.25=200（倍）。

2.3 确证试验结果 当内毒素标准溶液的Es值在0.5～2.0λ（包括0.5λ和2.0λ）时，而供试品的Et值在0.5～2.0Es（包括0.5Es和2.0Es）时，即无干扰作用。反之，则有。供试品的浓度在0.25EU/ml时，对以上3个样品的鲎试剂均未产生干扰作用。结果见附表2。

2.4 供试品的细菌内毒素检查试验 本试验条件下，按细菌内毒素检查法应用指导原则进行试验，可以用稀释方法排除干扰；对供试品用细菌内毒素检查法进行检测。

2.5 供试品检查

2.5.1 温度控制 实验前接通恒温仪电源，温度调至（37+1）℃。

2.5.2 细菌内毒素溶液制备

2.5.3 供试品阳性对照溶液的制备 分别取0.5ml 2倍浓度的供试品+0.5ml 4λ的内毒素制成混合均匀的供试品阳性对照溶液，备用。

2.5.4 鲎试剂的准备 取鲎试剂16支，0.1ml/支，按标示量加入BET用水复溶，备用。

2.5.6 试验加样 结果见附表3。

2.5.7 供试品细菌内毒素检查结果 见附表4。

3 结论

本研究结果表明，盲样70-B、70-C的细菌内毒素含量小于理论限值50EU/ml，70-A的细菌内毒素含量大于理论限值50EU/ml。

附表2 鲎试剂标示灵敏度复核试验结果

附表3 试验加样表（ml）

附表4 供试品细菌内毒素检查结果

4 讨论

4.1 由于细菌内毒素检查法操作简单、灵敏度高、重现性好，快速、方便，一次可检查多批检品，使用性强，故用本方法来检查细菌内毒素含量，达到安全用药的目的。

4.2 本文先通过干扰试验确定供试品的有效稀释浓度，再由确证试验进一步修整，以减少干扰试验的盲目性，避免浪费试剂，节省时间。鲎试剂要求的pH值范围和其他因素可以通过稀释来排除干扰[3][4]。

4.3 假阳性或高阳性的原因：①所用试管、针头、注射器未完全消除热原。②溶解鲎试剂时，用力太大，产生较多泡沫，产生假阳性。③操作环境污染。④鲎试剂的灵敏度不符合规定，易呈现高阳性。⑤由于凝聚反应是不可逆的，所以在恒温反应过程及观察结果时，应注意不要使试管受到振动，以免使凝胶破碎产生假阴性。⑥每次稀释倍数不得超过10倍。