不同类型应激对大鼠行为与脑组织基因表达影响比较

李野，徐思

不同类型应激对大鼠行为与脑组织基因表达影响比较

李野1，徐思2

目的：比较和分析心理应激与复合应激模型大鼠行为和脑组织基因表达差异。方法：测定心理应激与复合应激模型大鼠负重游泳力竭时间和游泳不动时间；提取大鼠脑组织mRNA与基因芯片杂交，扫描并转换数据，分析和比较基因表达变化的差异。结果：与正常对照组相比，两种应激模型大鼠游泳不动时间均显著延长，与复合应激模型大鼠相比，心理应激模型大鼠游泳不动时间更长；两种应激类型大鼠脑组织基因表达发生显著改变的基因有132条，其中：下调基因有81条相同，上调基因20条相同。结论：心理应激与复合应激都能显著降低大鼠主观驱动性；心理应激与复合应激对大鼠脑组织基因表达的影响作用相似，心理应激的影响更为显著和广泛。

心理应激；复合应激；大鼠行为；脑组织；基因表达

运动性心理疲劳是一个颇具争议的概念。目前学术界尚无统一的认识，相关研究多引用其他领域心理疲劳相关概念，如心理耗竭、慢性疲劳综合症、心理厌倦、过度训练的心理反应等。其中最有代表性的就是心理耗竭概念。而在运动训练与比赛条件下如何定义和判定运动性心理疲劳则尚无定论[1]。

心理疲劳与应激密切相关[2]，特定群体具有特定的应激压力特征。心理耗竭和心理厌倦等概念针对服务业从业人员和产业工人群体工作应激压力特征提出，指由于一定时期的情感压力、精神紧张、恶劣心境等心理应激因素持续作用或处于单调刻板的重复性操作状态引发的身心俱疲的心理感受，与生理疲劳关系不大[3-5]。运动性心理疲劳针对运动员这一特定群体提出概念，强调其运动性特征[6]。现代运动竞争激烈，运动员长期承受大负荷、高强度的训练和多种心理应激压力。心理应激因素与体力性疲劳等生理应激因素始终共存并相互叠加，两类应激因素共同作用于运动员，运动性心理疲劳发生机制与这种应激压力特征密不可分，这一特点使其区别于心理耗竭等概念。

心理应激与生理应激叠加作用是引发运动性心理疲劳的应激特征，这是运动性心理疲劳与单纯的心理应激所引发的心理耗竭的主要区别。本研究希望通过比较分析单纯心理应激因素与心理应激—体力性疲劳应激因素共同作用对大鼠行为与脑组织基因表达谱的影响来探讨运动性心理疲劳概念与心理耗竭概念的差别。

1 研究材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性SD大鼠，60只。体重（220±20）g，四川省实验动物养殖专场提供，合格证号：SCXK（川2004－15）。饲养条件：室温18℃～22℃，相对湿度60%～75%，光照时间12 h，单笼饲养，自由取食水。

1.2 试剂

ethidium bromide（EB，美国Sigma公司）；mbion转录试剂盒（美国AMBION公司）；Roche cDNA Synthesis System（瑞士Roche公司）；SIGMA PHENOL（美国SIGMA公司）；Micro Bio－Spin Chromatography Columns（美国Life Science公司）；Amersham Cy3（美国Life Science公司）；Express ChipTM RO2 Slides（美国MERGEN LTD）。

1.3 仪器

MICRO－4型杂交炉（英国HYBAID公司）。AFFYMETRS 418型芯片扫描仪（美国AFFYMETRIX公司）。WH－3微型旋蜗混合仪。J2－HC高速冷冻离心机。

1.4 方法

1.4.1 动物模型的建立实验前适应性饲养一周，将动物随机分为正常对照组、心理应激模型组和复合应激模型组，每组20只。在相同条件下（室温18℃～22℃，相对湿度60%～75%，光照时间12 h，单笼饲养），正常对照组大鼠自由取食水，不作处理。心理应激模型组大鼠每日上午定时在安静和黑暗环境条件下用50 mm×50 mm×200 mm的有机玻璃盒进行束缚，每日1次，每次60 min，连续4周。复合应激模型组大鼠每日上午定时在安静和黑暗环境条件下用50 mm×50 mm×200 mm的有机玻璃盒进行束缚，每日1次，每次60 min；每日下午定时置于游泳池（60 cm×70 cm×50 cm）内，水温为28℃±2℃，负重5%游泳30 min。连续4周。逐日作笼旁观察，记录实验动物一般状态。

1.4.2 大鼠游泳不动时间检测造模第19天模型组大鼠均不进行造模处理。将3组大鼠置于游泳池（60 cm×70 cm×50 cm）内，水温为28℃±2℃，不负重游泳，测定并累加记录大鼠5 min内游泳不动时间。

1.4.3 大鼠负重游泳时间检测造模第22天模型组大鼠均不进行造模处理。将3组大鼠置于游泳池（60 cm×70 cm×50 cm）内，水温为28℃±2℃，按动物体重的5%负重游泳，测定大鼠游泳力竭时间，以大鼠鼻部没入水下10 s不能抬起为力竭。记录游泳力竭时间。

1.4.4 大鼠脑组织基因表达谱检测末次造模处理结束后24 h内，将3组大鼠每组随机取8只，共16只大鼠断头处死，在冷冻条件下迅速取全脑，去掉小脑，迅速放入液氮罐中，后转移至－80℃保存备用每个标本分别用常规方法获得总RNA，通过逆转录得到cDNA。进而体外转录获得CY3标记的RNA探针。每个样品取25 μg探针与大鼠基因表达芯片杂交，32℃过夜后分别用1×SSC、0.2×SSC、0.1×SSC溶液洗涤3次，每次20 min，快速吹干后扫描。用ImagemenⅣ软件进行数据转换。芯片背景值设为100。基因表达值的分析有效范围在100～500000之间。

1.4.5 数据处理与分析将大鼠负重游泳时间与游泳不动时间数据导入SPSS 10.0进行统计处理。实验数据结果均以均数±标准差（X±SD）表示组间差异，用方差分析、T检验进行分析。基因表达丰度差异判断标准：将扫描前景数据数值减去背景数据，得到有效脑组织的基因表达丰度值。分别对两组各个基因表达丰度值求均值，将正常对照组基因表达丰度值均值与心理应激模型组基因表达丰度值均值进行比较，以丰度值比值≥2及≤0.5为有效基因筛选阈值标准。

2 结果与分析

2.1 正常对照组与心理应激模型组、复合应激模型组大鼠一般状态观察

实验期间笼旁观察表明，正常对照组大鼠一般状态良好，外观状态与行为无异常，皮毛光洁整齐，眼睛有神，神态安静，对外界反应正常适中，饮食、饮水均正常。与正常对照组相比，心理应激模型组大鼠外观状态尚可，皮毛略显凌乱污浊，对外界反应较为迟缓，或易激惹，行为较为迟缓，夜晚活动减少，取食、取水行为未见异常。与正常对照组相比，复合应激模型组大鼠外观状态略差，皮毛较为污浊，松脱不整，对外界反应较为迟缓，或易激惹，行为较为倦怠，白天多趴在笼角休息，夜晚活动减少，取食、取水、修饰行为减少。

2.2 心理应激与复合应激对大鼠游泳不动时间影响的比较

实验结果表明，与正常对照组大鼠相比，心理应激模型组大鼠与复合应激模型组大鼠游泳不动时间显著延长（P＜0.01）。其中，心理应激模型组大鼠游泳不动时间平均值长于复合应激模型组大鼠，但差异没有显著性，具体结果见表1。

根据煤层瓦斯测试资料统计分析，五轮山井田8号煤层甲烷含量8.2～26.8 m3/t，平均18.6 m3/t，甲烷浓度普遍较高，体积百分数为90.1%～99.9%，区域上呈现“中部高，水公河向斜轴部高，加戛背斜轴部低”的分布特点。8号煤的甲烷含量分布特征与加戛背斜以及水公河向斜的展布有关，整体上呈现NNW向的条带状分布特征。靠近加戛背斜轴部，断层明显增多，含气量偏低；加戛背斜与水公河向斜之间中部位置，煤层含气量最高；而水公河向斜轴部附近，含气量较高，表现出了向斜控气的特点(图2)。

表1 心理应激与复合应激对大鼠游泳不动时间的影响（n=20）Table 1 Effect of psychological stress and combined stres on forced swim time（FST）

2.3 心理应激与复合应激对大鼠负重游泳力竭时间影响的比较

实验结果表明，与正常对照组大鼠相比，心理应激模型组大鼠与复合应激模型组大鼠负重游泳力竭时间平均值均减少，但差异无显著性。其中，心理应激模型组大鼠负重游泳时间平均值短于复合应激模型组大鼠，差异没有显著性（见表2）。

表2 心理应激与复合应激对大鼠负重游泳力竭时间的影响（X±SD）Table 2 Effect of psychological stress and combined stress on exhaustive swim time

2.4 心理应激与复合应激对大鼠脑组织基因表达丰度影响的比较

分析基因芯片实验杂交结果表明：（1）与正常对照组相比，心理应激模型组大鼠脑组织共126个基因的表达丰度值发生显著性改变，其中表达丰度显著性下调（Ⅰ/Ⅱ≥2）的基因有100条；表达丰度显著性上调（Ⅰ/Ⅱ≤0.5）的基因有26条；复合应激模型组大鼠脑组织共109个基因的表达丰度值发生显著性改变，其中基因表达丰度显著性下调（Ⅰ/Ⅱ≥2）的基因有83条；表达丰度显著性上调（Ⅰ/Ⅱ≤0.5）的基因有26条。（2）心理应激模型与复合应激模型大鼠脑组织基因表达谱与表达丰度值比较结果显示，①在表达丰度值下调的基因当中，两组大鼠脑组织基因中共有81条相同基因的表达丰度值发生了趋向相同的显著性改变，有2条基因在复合应激模型组大鼠脑组织发生了显著性下调，而在心理应激模型组大鼠脑组织未发生显著性改变；有17条基因在心理应激模型组大鼠脑组织发生了显著性下调，而在复合应激模型组大鼠脑组织未发生显著性改变。②在表达丰度值上调的基因当中，两组大鼠脑组织基因中共有20条相同基因的表达丰度值发生了趋向相同的显著性改变，有6条基因在复合应激模型组大鼠脑组织发生了显著性上调，而在心理应激模型组大鼠脑组织未发生显著性改变；有6条基因在心理应激模型组大鼠脑组织发生了显著性上调，而在复合应激模型组大鼠脑组织未发生显著性改变。

在受影响的基因中，与细胞因子相关基因16条；与细胞膜与骨架相关蛋白有关的基因20条；与细胞信号转导通路蛋白相关基因23条；与细胞物质与能量代谢相关基因40条，结果见表3、表4、表5、表6。

表3 应激状态下表达丰度发生显著性改变的与细胞因子相关基因Table 3 Cytokine-related genes of which expression abundance significantly changed under stress state

表4 应激状态下表达丰度发生显著性改变的细胞膜与骨架相关蛋白基因Table 4Cytoskeleton-related genes of which expression abundance significantly changed under stress state

表5 应激状态下表达丰度发生显著性改变的细胞信号转导通路相关蛋白基因Table 5 Cellularsignaltransduction- related genes ofwhich expression abundance significantlychanged understress state

表6 应激状态下表达丰度发生显著性改变的物质与能量代谢相关蛋白基因Table 6 Metabolism-related genes of which expression abundance significantly changed under stress state

3 讨论

3.1 两种类型的大鼠应激模型的复制和行为学观察与比较

心理应激压力与生理性应激构成复合应激压力是运动员群体承受的应激特点，也是引发运动性心理疲劳的主要原因，同时，也是运动性心理疲劳与由单纯心理应激压力引发的心理耗竭的主要区别。比较和分析两种不同类型的应激压力作用下的大鼠模型的行为学特征，可以帮助我们理解和认识两个概念之间可能存在的差别。

将大鼠束缚并固定于不适体位是一种违反大鼠天性的状态，虽然物理刺激很小，但大鼠难以对此产生适应，由此而产生焦虑、愤怒、绝望和抑郁等慢性心理应激反应[7]。该模型可用于模拟由心理认知评价而产生的心理应激反应状态。

在对大鼠进行束缚使其处于心理应激状态的同时，采用负重游泳的方法使大鼠受到体力性疲劳应激刺激。两种造模因素共同作用模拟运动员群体感受的心理应激压力与生理性应激共同作用构成的复合应激压力。

强迫游泳试验（Forced Swimming Test FST）是一种对大鼠在应激压力下的主观驱动性进行检验和评价的经典实验[8]。将大鼠置于局限的深水池中，大鼠的本能反应是沿池周边积极探寻，试图找到出路逃离水池。当大鼠意识到无法逃离，身处无可回避的压迫环境时，即会处于一种漂浮不动的“行为绝望状态”。通过测定“行为绝望状态”时间可以评价大鼠的与绝望、抑郁相关的主观驱动性心理状态。

3.2 心理应激与复合应激对大鼠的脑组织基因表达谱影响的差异比较与分析

3.2.1 心理应激与复合应激对脑组织基因表达的影响模式相似心理应激与复合应激对基因表达丰度值的影响模式非常相似。其中表达量显著下调的基因有81条相同，表达量显著上调的有20条相同；变化趋势也基本相同。反映出的中枢神经系统变化主要包括以下几点。

第一，脑组织基因表达总体上以抑制为主。（1）与物质-能量代谢有关的代谢酶类基因表达丰度下调，如脂肪酸CoA连接酶（Rn.33697）、脂酰CoA水解酶（Rn.6024）、细胞色素b（Rn.1055）、ATP酶（Rn.11016、Rn.6167）、细胞色素氧化酶（Rn.846）等均发生显著下调；与转录翻译相关的基因表达显著下调，如活化转录因子（Rn.2423）、翻译延长因子（Rn.971）、聚合酶（Rn.28212）、锌指转录因子早期相应蛋白（Rn.31998）等；与蛋白质合成相关核糖体蛋白（Rn.3391、Rn.2139、Rn.2177、Rn.4153）表达丰度显著性下调；与蛋白质分解代谢相关基因表达显著下调，如泛素（Rn.1253）、泛素特异的蛋白酶（Rn.19491）。（2）与细胞信号转导相关蛋白质基因表达丰度显著性下调，如二酰甘油激酶（Rn.11413）、甲状腺素受体交互因子（Rn.10814）、蛋白质酪氨酸磷酸酯酶（Rn.18651）、酪氨酸蛋白激酶（Rn.2801）、腺苷酸环化酶相关蛋白（Rn.10229）、磷脂酶C（Rn.11243）、G蛋白偶联受体（Rn.48760）、cGMP刺激的磷酸二酯酶（Rn.10044）等。（3）神经细胞分泌与胞浆运输活动相关蛋白基因表达丰度显著下调，如神经纤维蛋白（Rn.10971）、膜蛋白分泌型载体蛋白（Rn.7309、Rn.9151）、细胞质肌动蛋白（Rn.35769）等。（4）神经递质调质多肽表达丰度显著下调，如神经肽Y（Rn.9714）、速激肽（Rn.9708）。（5）抑制性神经递质相关蛋白基因表达丰度显著上调，如Na+/H+偶联的谷氨酸盐转运体（Rn.4328）。

第二，细胞膜-骨架系统受到自由基攻击损伤可能是造成应激状态神经系统反应的主要机理之一。（1）细胞质肌动蛋白由αβ亚基聚合成肌纤维并通过“踏车”作用延长，含有神经递质的囊泡沿着肌纤维运动产生神经细胞轴突运输，肌动蛋白β亚基和动力蛋白的功能域富含Cys，易于受到自由基的攻击而造成损伤，导致αβ亚基无法聚合成肌纤维。肌动蛋白聚合受到抑制，其中一个亚基蛋白质有效浓度减少，引起细胞质肌动蛋白亚单位（Rn.35769）丰度下调和细胞质动力蛋白（Rn.11014，Rn.44896）上调同时出现。（2）脑组织细胞抗自由基系统相关蛋白基因（Rn.956、Rn.4234、Rn.5878、Rn.5990、Rn.29777、Rn.29982等）表达丰度发生的改变可以证明在应激大鼠脑组织中确实存在明显的自由基的损伤过程。（3）脂肪酸去饱和酶（Rn.28161）基因表达下调提示细胞膜抗氧化功能可能受到损伤。

第三，脑组织神经细胞钙负荷发生明显改变并可能引起细胞凋亡的发生。与钙调节相关蛋白（Rn.4851、Rn.6822）表达丰度上调，而钙调蛋白（Rn.5968）、钙离子交换载体蛋白（Rn.2938），钙离子通道蛋白（Rn.23698）表达丰度下调，提示我们：脑组织细胞处于高钙负荷状态。钙离子浓度过高能够导致细胞凋亡的发生，这可能是应激对脑组织细胞的损伤途径之一。BCl-2（Rn.2060）基因表达水平大幅提高接近20倍，证明应激大鼠脑组织细胞出现抗凋亡反应。侧面证实了上述观点。

第四，细胞信号转导通路蛋白可能受到损伤。RAS蛋白是小G蛋白信号转导通路上的关键因子，通过焦磷酸法呢醇基锚定在细胞膜上发挥功能。膜RAS（Rn.1016）基因表达丰度下调，同时有RAS相关蛋白（Rn.2587）、RAB12膜RAS（Rn.11021）和法呢基转移酶（Rn.5990）基因表达丰度上调，提示存在RAS相关信号通路的损害，其作用点是RAS蛋白锚定亚基的焦磷酸法呢醇基。

第五，应激状态影响免疫系统机能。细胞素（Rn.53987）、白介素受体（Rn.29849）、干扰素相关调节因子（Rn.3723）前胸腺素（Rn.817）等蛋白质基因表达水平的改变提示我们，应激状态下大鼠免疫机能受到影响。

3.2.2 复合应激状态对脑组织基因表达水平影响更大复合应激大鼠脑组织基因表达丰度变化更明显，考虑到复合应激大鼠应激强度大于心理应激大鼠，可以认为脑组织基因表达对两种类型的应激的适应性调控趋势是相同的。

3.2.3 心理应激状态对脑组织基因表达的影响更为广泛体现出中枢神经系统对于“厌倦焦虑、绝望”等主观感受性应激压力的反应过程十分复杂。

4 小结

综上所述，心理应激与复合应激对于中枢神经系统的影响在本质上是相同的。二者都会降低运动主观驱动性，对脑组织基因表达的影响模式也基本相同。另一方面，与复合应激模型大鼠相比，心理应激模型大鼠表现出运动主观驱动性较低，脑组织基因表达谱受到的影响也更广泛，提示我们，如果能够较好的适应运动训练带来的体力性疲劳等生理应激，运动训练可能有助于调节各种心理因素带来的应激压力；当心理应激与生理应激都无法适应时会促使运动性心理疲劳的发生。较为丰富的外界刺激，包括运动训练，可能有助于防止心理耗竭的发生。

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Comparison and Analysis of Ethological Pattern and Gene Expression of Brain Tissue between Psychological Stress and Combined Stress

LI Ye1，XU Si2
（1.School of PE，Sichuan Normal University，Chengdu 610101，China；2.Institute of Experimental Animal，People Hospital of Sichuan Province，Academic of Medicine of Sichuan Province，Chengdu 610212，China）

Aim：To compare and analyze the differences of the ethological pattern and brain tissue gene expression between psychological stress and combined stress in rat.Method：To determinate the loading swim time（LST）and forced swim time（FST）of both model groups；The mRNA which to be extracted from the brain tissue of both model group rats，were hybridized with Oligo microarray，and were screened through the analysis of gene expression profile，and to compare and analyze the change of gene expression.Results：The FSTs were extended in both model groups significantly.Compared with combined stress group，the FST were longer in psychological stress group.Totally，132 genes of the brain tissue were influenced in both groups，where the 81 down-regulated genes and 20 up-regulated genes were the same in both groups.Conclusion：Both types of stress can reduce the psychological impulse，and have similar influence on the gene expression of brain tissue in rat，the effects of psychological stress are more significant and wide-ranging.

psychological stress；combined stress；rat behavior；brain tissue；gene expression

G 804.7

A

1005-0000（2011）01-0080-06

2010-05-05；

2010-12-06；录用日期：2010-12-10

李野（1974-），女，吉林伊通人，讲师，研究方向为体育理论、运动训练学。通讯作者：徐思（1971-），男，吉林长春人，副研究员，研究方向为生物信息学与药理学。E-mail:bearpp@126.com。

1.四川师范大学体育学院，四川成都610101；2.四川省医学科学院·四川省人民医院实验动物研究所，四川成都610212。