利用bFGF包裹的纳米磁性颗粒对大鼠急性骨骼肌钝挫伤恢复过程中收缩应力及MHC-Ⅱb表达影响研究

李骁君

利用bFGF包裹的纳米磁性颗粒对大鼠急性骨骼肌钝挫伤恢复过程中收缩应力及MHC-Ⅱb表达影响研究

李骁君

利用纳米磁性颗粒将bFGF定位于大鼠骨骼肌钝挫伤部位，考察该方法对大鼠急性骨骼肌钝挫伤恢复过程中收缩应力及MHC-Ⅱb表达影响。研究结果表明，bFGF对大鼠腓肠肌钝挫伤后第17、24天的收缩力有明显提高。损伤后第2～10天，bFGF包裹组与其余各组之间的MHC-Ⅱb mRNA表达差异显著（P＜0.05）。因此，磁纳米化的bFGF能明显改善大鼠急性骨骼肌钝挫伤后的收缩应力衰减，显著促进损伤肌肉MHC-Ⅱb mRNA的表达，改善损伤肌肉再生和结构修复。

纳米磁颗粒；碱性成纤维细胞生长因子；骨骼肌钝挫伤MHC-Ⅱb

肌肉损伤是运动过程中难以避免的一类运动损伤[1－4]。运动创伤后，肌纤维遭到破坏，会产生微循环的紊乱及炎性细胞的浸润及肌肉组织的血肿机化等，对运动员的运动能力、运动寿命均构成了潜在威胁。研究表明，通过肌肉再生修复可以在一定程度上对肌肉功能有一定的恢复，但肌肉的结构和功能完全康复存在一定难度[5]。近些年，随着肌肉损伤研究的不断深入，以及基因治疗技术不断增强，通过基因工程手段让受损肌肉组织中潜在的卫星细胞以及成纤维细胞更及时、更快地分化、增殖成为肌肉损伤恢复的一个新的研究课题。

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）可以促进成纤维细胞增殖、分化，是肌肉早期再生过程中一种重要的生长因子[6]。研究表明，外源性bFGF对骨骼肌肌原细胞有明显的增殖作用，从而加快损伤肌肉修复[7]，说明bFGF是一种有效的治疗肌肉损伤分子制剂。因此，将bFGFs基因导入损伤部位并发挥作用，能够弥补由于机体自身产生生长因子缓慢而有限的缺点，为肌肉损伤恢复提供更加充足的碱性成纤维细胞生长因子，从而促进肌肉再生过程。本研究通过利用bFGF包裹磁性（Fe3O4）纳米粒，皮下注射急性骨骼肌钝挫伤大鼠模型，在外加磁场（永磁梯度场）的牵引下靶向聚焦至肌肉损伤部位。通过对骨骼肌钝挫伤后的收缩力特性的测试研究，及对腓肠肌Ⅱb型肌球蛋白重链（myosin heavy chain－Ⅱb，MHC－Ⅱb）mRNA表达的影响，探讨靶向定位的bFGF在骨骼肌再生和恢复过程中的促进作用，从而为其进一步的临床应用提供实验依据。

1 研究材料与方法

1.1 bFGF包裹磁性纳米粒和小牛血清白蛋白（BSA）包裹磁性纳米粒的制备

在本实验中，免疫磁性纳米粒制备试剂盒由北京金纳信生物科技有限公司提供，按试剂盒使用说明书步骤进行操作。重组鼠碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和小牛血清白蛋白（BSA）分别购自上海欣百诺生物科技有限公司和美国Sigmaaldrich公司。

1.2 实验动物和分组

雄性Wistar大鼠126只，体重（210～230）g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。采用国家标准啮齿类动物饲料饲养，自由摄食饮水，环境温度（20～24）℃，相对湿度40%～60%，光照时间12 h。随机分为bFGF包裹磁性纳米粒组、BSA包裹磁性纳米粒组、生理盐水组及自然愈合组；依据不同的观察时间点，每大组再分为4小组（损伤后第2、10、17、24和30天），每小组6只大鼠。另取6只未经任何处理的大鼠作空白对照。

1.3 骨骼肌钝挫伤模型的制备

参照陈世益等[8]的骨骼肌钝挫伤模型制备方法，将雄性Wistar大鼠用10 g/L硫喷妥钠麻醉后，重物下落导致一次打击伤。致伤部位为右小腿内侧面（其皮下为腓肠肌中段），致伤物为一段固体木制圆柱体，打击面直径110 cm，下落物体长20 cm，质量620 g，从40 cm高处落下，重力6108 N，动能2143 J。解剖证实骨骼肌钝挫伤成功率达100%。

1.4 药物处理

骨骼肌钝挫伤后即刻，分别于损伤部位进行肌膜外注射bFGF包裹磁性纳米粒、BSA包裹磁性纳米粒或生理盐水，注射量均为1 mL/（只·次），以后每隔7天注射一次，直至取样测定。注射完毕，利用自制的磁靶向定位磁体装置（见图1）对损伤部位实施磁场牵引和聚焦，时间1 h。

图1 磁靶向定位磁体装置Figure 1 Homemade magnetic drug targeting apparatus

1.5 肌肉收缩力的测定和计算

分别于损伤后第2、10、17、24和30天随机取材，6只（次·组）。实验测定参照张胜年的方法[9]，即动物用0.5%戊巴比妥钠麻醉后，令其俯卧固定十大鼠固定板上，分离其右侧小腿后部皮肤及其表层肌肉、腱膜，使得肌肉收缩力测试在肌肉半离体状态下进行。收缩力计算参照张胜年[8]的方法。

1.6 实时荧光定量PCR法测定大鼠MHC-ⅡbmRNA表达

采用Trizol（Invitrogen）法抽提大鼠腓肠肌总RNA，经无RNA酶的DNase I（TaKaRa）处理，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，PCR检测基因组DNA的消化情况，紫外分光光度计定量。取1.0 μg总RNA进行反转录（Superscript II，Invitrogen），以形成的cDNA第一链作为模板，使用Light cycler－faststart DNA master SYBR green I试剂（Roche），在Light Cycler PCR仪（Roche PTC－225）上进行实时荧光定量PCR扩增。PCR体系为：Mg2+浓度3 mmol/L，引物浓度0.4 μmmol/L，95℃变性10 min，95℃10 s，60℃5 s，72℃15 s，78℃测定荧光强度，40个循环；75℃至95℃绘制溶解曲线。

引物由上海生工生物工程技术有限公司合成，以β－actin为内参照，其正向引物：5'－TGC CGC ATC CTC TTC CTC－3'，反向引物：5'－CCA CAG GAT TCC ATA CCC AG－3'，扩增片段长度132 bp。MHC－Ⅱb正向引物：5'－TGG CAG AAT GGA AAC AGA AG－3'，反向引物：5'－TGC TCG GTC AGG TCA GAA AT－3'，扩增片段长度l87 bp。

实验组与对照组样品成对比较，ΔΔCT法相对定量。以内参照的值进行归一化处理。每组检测6个平行样，3次独立的重复实验相互验证。

1.7 统计学分析

所有实验数据均以平均数±标准差（X±S）表示，采用SPSS12.0统计软件进行分析，各组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用T检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 bFGF包裹磁性纳米粒的制备

利用免疫磁性纳米粒和bFGF，制备bFGF包裹的磁性纳米粒。扫描电镜结果显示，磁性纳米粒大小较均匀，平均直径（100～120）nm（见图2A）。磁滞回线（见图2B）和红外光谱（见图2C）分析表明，bFGF包裹的磁性纳米粒具顺磁性质，表面结构上存在多羟基和羰基基团，具备良好的亲水性和生物相容性。

图2 制备的磁性纳米粒药物（A）及磁滞回线（B）和红外光谱（C）分析Figure 2 Magnetic nanoparticles modified with bFGF and characterization with loop hysteresis and infrared spectrum

2.2 钝挫伤肌肉收缩应力的变化

如表1所示，与空白对照组相比，各组肌肉收缩力第2天均显著降低（P＜0.05），到第10天及以后无显著变化。与自然愈合组、生理盐水组和BSA包裹磁性纳米粒组相比，bFGF包裹磁性纳米粒组收缩力在第17、24天时均显著升高（P＜0.05），第17天达高峰。与空白对照组相比，尽管各组第30天收缩力略有升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 大鼠腓肠肌钝挫伤后收缩应力的变化（n=6）Table 1 Changes in muscular contractive strength ingastrocnemius after contusion

2.3 各组处理对钝挫伤大鼠腓肠肌MHC-Ⅱb mRNA表达的影响

设空白对照组的相对表达量为1（取对数后为0），故只比较自然愈合组、生理盐水组、BSA包裹组、bFGF包裹组和bFGF直接注射组之间的MHC－Ⅱb mRNA表达情况。骨骼肌钝挫伤后第2天，自然愈合组、生理盐水组、BSA包裹组3组之间MHC－Ⅱb mRNA表达无显著变化（P＞0.05），但bFGF包裹组&bFGF直接注射组与上述3组间表达差异显著（P＜0.05），bFGF包裹组和bFGF直接注射组二者之间表达差异不显著（P＞0.05）。损伤后第2天，自然愈合组、生理盐水组和BSA包裹组的MHC－Ⅱb mRNA表达开始迅速上升，到损伤后第17天达到峰值。此后迅速下降，在损伤后第30天恢复到接近正常对照组水平。

图3 各组处理对钝挫伤大鼠腓肠肌MHC-ⅡbmRNA表达的影响Figure 3 Effects of treatments on the expressions of MHC-Ⅱb mRNA in gastrocnemius after contusion

损伤后第10天，bFGF包裹组的MHC－Ⅱb mRNA表达不仅仍显著高于自然愈合组、生理盐水组和BSA包裹组（P＜0.05），亦显著高于bFGF直接注射组（P＜0.05）。损伤第17天后，其MHC－Ⅱb mRNA表达水平与上述四组无显著差异（P＞0.05）。与自然愈合组等三组相比，bFGF包裹组和bFGF直接注射组的MHC－Ⅱb mRNA表达变化趋势相似，均在损伤后第10～17天上升至峰值，然后迅速下降近正常表达水平。在损伤后第2天，bFGF包裹组的MHC－Ⅱb mRNA表达平均水平是自然愈合组的47.5倍，而bFGF直接注射组的MHC－Ⅱb mRNA表达平均水平是自然愈合组的44倍。

3 讨论

骨骼肌损伤后，受损肌肉肌纤维坏死、水肿和血肿迅速形成，中性粒细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润，吞噬细胞残骸，分泌细胞因子，肌卫星细胞被激活并增生、分化，形成新的肌纤维[9]。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在创伤修复过程的3个阶段，即局部炎症反应阶段、细胞增殖分化及肉芽组织形成阶段、组织重建阶段均有不同程度的促进作用[10－12]。在炎症期，bFGF对创伤细胞有明显的趋向活性，刺激成纤维细胞，血管内皮细胞等向创伤部位移动。当细胞迁移至损伤部位时，开始进入增殖和修复期。肉芽组织的形成是非常关键的时期，其本质是大量的毛细血管和丰富的成纤维细胞，bFGF正是成纤维细胞、血管内皮细胞及血管平滑肌细胞的高效促生长剂，能够显著增加肉芽组织毛细血管数量和血液流量，改善创面微循环，为组织修复提供所必须的氧及丰富的营养物质；同时，bFGF对损伤组织部位神经纤维的再生也有显著的促进作用，加速损伤组织功能的恢复[10－12]。

本研究利用免疫化学偶联技术，以重组bFGF包裹磁性（Fe3O4）纳米粒，注射急性骨骼肌钝挫伤大鼠模型，在外加永磁梯度场的牵引下靶向聚焦至肌肉损伤部位。肌肉挫伤后，肌肉收缩力的下降取决于肌肉纤维的断裂比例、炎症反应、痛疼痛反应和中枢系统的反射控制。结果显示，bFGF对大鼠腓肠肌钝挫伤后第17、24天的收缩力有明显提高；同时，bFGF在较短时间内（损伤后第2天）即能使应力松弛恢复接近正常肌肉水平。损伤后第17和24天，bFGF处理组恢复为正常肌肉的140%和131%。因此，从损伤肌肉的收缩力研究结果来看，bFGF一定程度上能促进大鼠急性骨骼肌钝挫伤后肌肉再生和结构修复，提高愈合质量。

骨骼肌损伤修复过程中MHC－Ⅱb mRNA的表达结果显示，与自然愈合组等相比，bFGF包裹组在伤后2～10天内MHC－Ⅱb mRNA的表达快速上升并达到峰值；随后迅速下降和恢复至正常水平。这表明bFGF促进大鼠急性骨骼肌钝挫伤后肌肉再生和结构修复与促进损伤肌肉MHC－Ⅱb mRNA的表达相关，其机制可能与bFGF是一种促细胞分裂剂、能调控和促进信号传导分子的表达有关[14]。

本研究也显示，携载药物的生物相容性磁性纳米粒在外加永磁梯度场的牵引下，能较好地靶向定位于病灶区，发挥治疗和修复作用。这对于进一步深入开展磁性纳米药物在运动医学和创伤学上的应用也提供了一个良好的尝试和启迪。

4 小结

碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）能明显提高大鼠急性骨骼肌钝挫伤后的收缩应力衰减，显著促进损伤肌肉MHC－Ⅱb mRNA的表达，改善损伤肌肉再生和结构修复，提高愈合质量。

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Muscle Contractive Strength and MHC-Ⅱb Express in Rat Skeletal Muscles after Acute Contusion by Using Basic Fibroblast Growth Factor-Coated Magnetic Nanoparticles

LI Xiaojun
（Dept.of Fundamental Theories，Shandong Sports University，Jinan 250063，China）

To study the effects of basic fibroblast growth factor（bFGF）－coated magnetic nanoparticles on the recovery and regeneration in rat skeletal muscles after acute contusion.bFGF could significantly increased the muscle contractive strength at day 17 and day 24 in gastrocnemius after contusion.From day 2 after contusion，bFGF could restore the muscle relaxation back close to the normal level.The bFGF－coated group was significantly different from other four groups in the expression of at day 2－10 after contusion（P＜0.05）.The bFGF－coated group could significantly enhance the contractive strength，promote the expression of MHC－Ⅱb mRNA，and improve the regeneration and structure healing of injured muscles in rat acute skeletal muscle contusion.

magnetic nanoparticle；bFGF；skeletal muscle contusion MHC－Ⅱb

G 804.5

A

1005-0000（2011）01-0034-03

2010-06-08；

2010-12-15；录用时间：2010-12-20

山东省自然科学基金项目（项目编号：Y2007C116）

李骁君（1970-），男，山东济南人，副教授，研究方向为运动与糖脂代谢、体能训练的机能应答。

山东体育学院基础理论系，山东济南250063。