十种中药提取物与抗生素合用对铜绿假单胞菌最小抑菌浓度影响的体外实验

赵 敏，谭钢文，唐小异，龙灵芝，周 源

（湖南师范大学医学院，湖南 长沙 410006）

铜绿假单胞菌 (Pseudomonas aeruginos，PAE)为医院内重要的条件致病菌之一，人体免疫力低下时，如长期应用激素类药物、抗肿瘤药物、免疫抑制剂、严重创伤或医疗操作如气管切开等，更容易感染PAE菌且死亡率高[1-2]。广谱抗生素的大量应用使铜绿假单胞菌耐药率增高，给临床治疗带来困难[3-4]。二十世纪80年代开始，中草药作为天然、毒、副作用小的细菌耐药性抑制剂，显示了良好的应用前景。黄连具广谱抗菌活性，黄芪是常见的益气健脾中药之一，具有明显的提高机体免疫和促进肠胃功能等作用[5-6]。本研究对黄连等10种中药材进行常规提取，观察各提取物处理后，抗生素对铜绿假单胞菌抑制作用的变化。

1 材料与方法

1.1 药品

氨苄西林钠注射液(1.0g/支，哈药集团制药总厂，批号 A080515713)、头孢他啶注射液(1.0g/支，山西威奇达药业有限公司，批号 20081209)。黄柏、黄芩、槐花、连翘、防己、黄连、苦参、穿心莲、蛇床子、麻黄等中药购自湖南高桥大市场药材公司亚飞经营部并经本院生药室鉴定。

1.2 菌种及仪器

耐药铜绿假单胞菌由本院微生物实验室提供；Tu-1800SPC紫外可见分光光度计，YC7124真空泵，HH-S恒温水浴锅，YXQ-2S-S0S1高压蒸汽灭菌器，METTLER TOLEDO PL403电子精密天平；YXQ-LS-50SI立式压力蒸汽灭菌器，eppendorf 5804R冷冻离心机，PYX-150S-A生化培养箱，SW-CJ-2F净化工作台。

1.3 方法

1.3.1 中草药提取物的制备

黄芩、黄芪、槐花、连翘、防己等采用乙醇回流法制备：中药材经自然风干、粉碎，过100目筛，各称取50 g，加50%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并滤液，重结晶后溶于蒸馏水，浓缩(相当于原药0.5 g/mL)、高压蒸汽灭菌，编号后置于4℃冰箱中保存备用。黄柏采用碱提法，常压加热煎煮法制备黄连、麻黄、苦参、蛇床子、穿心莲提取物，浓缩至1:1(相当于1 g/mL)，十种中药提取物经无菌滤纸滤过、除菌，装瓶4℃保存备用[7]。

1.3.2 平板打孔法测定铜绿假单胞菌对抗生素、中药提取物的敏感性

将铜绿假单胞细菌划线接种于琼脂培养平板上，分别加入稀释浓度为1 g/mL的氨苄西林、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星注射液，十种中药提取物，37℃恒温培养18 h，观察有无抑菌环。以平板打孔法定性测试药物对铜绿假单胞细菌有无抑制作用。

1.3.3 对倍稀释法测定抗生素的最小抑菌浓度

取10个透明离心管，各加入2 mL MH液体培养基，往1号管中加入一定浓度的抗生素溶液，震荡均匀后吸取2 mL加入2号管，依次类推至10号管震荡均匀后，吸取2 mL弃去，加入稀释菌液50 μL，37℃恒温培养18 h，测定多次二倍梯度稀释后，各抗生素对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC 1)。

1.3.4 中药提取液对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度

取10个透明离心管，分别加入1 mL对应的中药和1 mL MH液体培养基，加入稀释菌液50 μL，37℃恒温培养18 h，离心后取沉淀，加MH培养基稀释。发现黄芩、连翘药液培养基中无细菌生长，测黄芩和连翘提取物的最小抑菌浓度(MIC 2)。

1.3.5 平板打孔法定性检测中药处理后是否恢复耐药菌对抗生素的敏感性

用10个MH平板分别涂上原菌或经中药处理的铜绿假单胞菌，每板打三个孔，分别标记为阿米卡星、氨苄西林和头孢他啶，加入对应的抗生素溶液100 μL。37℃恒温培养18 h，观察抑菌环大小，确定中药是否恢复了细菌对抗生素的敏感性。

1.3.6 二倍梯度稀释法比较抗生素对经10种中药处理菌与原菌的最小抑菌浓度

从1.3.4得到可使抑菌环增大的中药和/或抗生素的组合，加入的菌液按10种中药培养菌和原菌分为11个组。培养后观察各管中有无细菌生长，确定各组药物的抗菌作用(MIC 3)，反复以二倍梯度稀释法观察中药单用或与抗生素合用后MIC的变化。

2 结果

2.1 单用中药提取物的抗铜绿假单胞菌作用

平板打孔法测定，分别单独加入黄柏、槐花、防己、黄连、苦参、穿心莲、蛇床子、麻黄等中药提取物的培养基均无抑菌环出现，提示以上中药的提取物单用对铜绿假单胞菌无明显抑制作用。

2.2 单用抗生素对抗铜绿假单胞菌作用

二倍梯度稀释法测定，阿米卡星、氨苄西林和头孢他啶对耐药铜绿假单胞菌有抑制作用，最小抑菌浓度分别为0.050，0.008，0.001 g/mL，头孢他啶抑菌作用最强。而庆大霉素原浓度药液(1mL:4万单位)也不能抑制铜绿假单胞菌生长，故后续实验弃用。结果见表1。

表1 抗生素对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(g/mL)

2.3 二倍梯度稀释法测定黄芩和连翘提取物的最小抑菌浓度

结果发现，黄芩提取物经三次二倍稀释、连翘提取物经四次二倍稀释后，仍可产生抗菌作用。结果见表2。在后续实验中采用0.125 g/mL黄芩或0.1125 g/mL连翘处理细菌培养基。

表2 黄芩和连翘提取物对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(g/mL)

2.4 平板打孔法测试十种中药的提取物分别与抗生素、氨苄西林或头孢他啶合用后，是否恢复细菌对抗生素的敏感性，测得抑菌环结果见表3。

表3 氨苄西林、头孢他啶单用或与中药提取物合用后的抑菌环直径

结果显示，氨苄西林和头孢他啶对黄芩、连翘、黄连、穿心莲、麻黄5种中药处理后，抑菌环直径大于单用一种抗生素产生的抑菌环(单用氨苄西林1.8 cm，单用头孢他啶4.5 cm)，提示以上5种中药可增加铜绿假单胞菌对氨苄西林和头孢他啶的敏感性。

2.5 经反复进行二倍梯度稀释，测定最小抑菌浓度

结果显示，经黄芩处理后，氨苄西林对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度降为0.004 g/mL，为单用时MIC(0.008 g/mL)的一半。而头孢他啶经15次二倍稀释后仍呈现抗菌活性，最小抑菌浓度由单用时0.001g/mL降为3.87×10-6g/mL；经黄连处理后，亦得到类似结果。提示黄芩或黄连可提高铜绿假单胞菌对氨苄西林的敏感性，黄芩或黄连可明显提高铜绿假单胞菌对头孢他啶的敏感性。见表4。

表4 黄芩、黄连和抗生素合用后的最小抑菌浓度(g/mL)

3 讨论

铜绿假单胞菌对多种常用的抗菌药物耐药率较高，呈现逐年上升趋势，耐药机制包括产生多种灭活酶、外膜孔蛋白OprD2的缺失、外膜的通透性降低以及主动外排泵机制等。因铜绿假单胞菌具有多药耐药性的特点，故治疗其所致感染可供选择的有效抗菌药物甚少[8]。用于逆转细菌耐药性的中药多为清热解毒、利湿通淋类药物，如黄芪、黄柏、黄连、金银花、马齿苋、射干、大黄、五倍子、苍术、石芽茶等以及相应的复方制剂，如黄连解毒汤、三黄片、止痢灵等。近年的研究报道，黄芩、黄连、黄柏、连翘和千里光对产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及持续高产AmpC酶菌株均有不同程度的抑制作用，黄芩抑菌效果较好，其次为黄连和千里光等[9]。最近研究报道，铜绿假单胞菌具有极强的生物膜形成能力，生物膜的形成可明显降低其对抗菌药物的敏感性甚至产生耐药，常给临床治疗带来很多困难，黄芩苷可抑制和破坏生物膜，并增强头孢他啶对生物膜内铜绿假单胞菌的抗菌活性。本研究采用平板打孔法及二倍梯度稀释法研究了10种中药提取物对铜绿假单胞菌的影响。实验结果表明，黄芩、黄连处理后，氨苄西林和头孢他啶对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度显著降低，提示黄芩、黄连与以上抗生素合用有协同抗菌作用，作用机理是否与影响铜绿假单胞菌生物膜的结构或功能有关，需进一步研究证实。

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