菊糖及其酶解产物对长双歧杆菌的促生长作用

张建平，张泽生，王金菊

(1. 天津科技大学海洋科学与工程学院，天津 300457；2. 天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

菊糖及其酶解产物对长双歧杆菌的促生长作用

张建平1，张泽生2，王金菊2

(1. 天津科技大学海洋科学与工程学院，天津 300457；2. 天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457)

研究了长双歧杆菌在分别以葡萄糖、菊糖和菊糖酶解所得低聚果糖为碳源的培养基中的生长情况，在这些培养基中，长双歧杆菌最高菌体质量浓度分别是0.30、0.37、0.41,g/L，在以菊糖和低聚果糖为碳源的培养基中的增殖情况要好于以葡萄糖为碳源的培养基，通过原子力显微镜对长双歧杆菌的形态进行观察，发现在分别以菊糖和葡萄糖为碳源的培养基中其形态无明显差别．

长双歧杆菌；菊糖；低聚果糖

Abstract：The grow th instance of Bifitdobacterium longum at part w ith glucose，inulin，oligomerization levulose for carbon source culture medium was studied. The supreme thallus concentration in these cultures part was 0.30，0.37 and 0.41,g/L，the proliferation instance of Bifitdobacterium longum at part w ith inulin and oligomerization levulose for carbon source culture medium was better than that which was cultured in the culture which carbon source was glucose can be found through the medium of date. Through the medium of AFM versus，it was found that the shape of Bifitdobacterium longum at part with inulin and glucose for carbon source has no distinceness difference.

Keywords：Bifitdobacterium longum；inulin；oligomerization levulose

双歧杆菌(Bifidobacterium)是1899年由法国学者Tissier从母乳营养儿的粪便中分离出的一种厌氧的革兰氏阳性杆菌，末端常常分叉，故名双歧杆菌，它具有维护肠道正常细菌菌群平衡、抑制病原菌的生长、防止便秘等功能[1]．但双歧杆菌分布在胃肠的数量随年龄阶段的增长而减少[2]，所以，如何提高成人体内的双歧杆菌活菌数成为现今最受关注的课题之一．研究[3]发现，一些低聚果糖可以促进双歧杆菌的增殖．菊糖是由D–呋喃果糖分子以β–(2，1)糖苷键连接生成的直链多糖[4]．本实验研究菊糖和菊糖酶解所得的低聚果糖对长双歧杆菌生长和形态的影响，为找到更有效、成本更低的长双歧因子奠定一定的理论基础．

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

长双歧杆菌(Bifitdobacterium longum)，购于中国工业微生物菌种保藏中心．

1.1.2 培养基

活化培养基：大豆蛋白胨0.5,g，胰蛋白胨0.5,g，酵母糖1.0,g，葡萄糖1.0,g，无机盐溶液4,m L，蒸馏水100,m L，半胱氨酸盐酸盐0.05,g(培养基煮沸后加入)，pH,7.0．此培养基在接种前煮沸驱氧后接种，于厌氧环境下培养．无机盐溶液：CaCl2(无水)0.2,g，MgSO4·7H2O,0.48,g，K2HPO4,1.0,g，KH2PO4,1.0,g，NaHCO3,10.0,g，NaCl,2.0,g．混合CaCl2和MgSO4在300,m L蒸馏水中直至溶解，加500,m L蒸馏水，边搅拌边缓慢加入其他盐类至全部溶解，加200,m L蒸馏水混匀，4,℃下保存备用．

菌体增殖培养基：将葡萄糖碳源替换为实验用碳源适量．

上述各培养基均经121,℃灭菌30,m in 后使用．

1.2 方法

1.2.1 菊糖低聚果糖的制备[5]

按本实验室建立的方法制备，相对分子质量为509，聚合度为2～3．

1.2.2 长双歧杆菌菌体活化和增殖培养

在100,m L三角瓶中装入50,m L活化培养基，121,℃灭菌30,m in后趁热塞紧橡皮塞．采用萃裂法开启安瓿管，利用无菌吸管吸取5.0,m L培养基至安瓿管，充分洗涤冻干菌粉至三角瓶，然后塞紧橡皮塞，恒温37,℃，定时摇晃小三角瓶，厌氧培养36,h得长双歧杆菌菌种母液．

在10,m L的具塞螺纹试管中加入9,m L 菌体增殖培养基，121,℃灭菌30,m in 后趁热旋紧试管塞．接入菌种母液1.0,m L(接种量10%)．恒温37,℃厌氧培养，定时摇晃培养试管．

长双歧杆菌是厌氧菌，需厌氧培养．厌氧缸法是一种简便实用的厌氧培养方法，适用于小规模厌氧菌培养．厌氧缸是普通的干燥缸，把接种好的长双歧杆菌液体培养基试管放入厌氧缸内，然后在缸内点燃一支蜡烛，盖好缸盖，用凡士林封口，蜡烛熄灭后，缸内就形成了厌氧环境．

1.2.3 长双歧杆菌菌体浓度的测定

采用干质量法和比浊法相结合的方法[6–7]：在620,nm下测定长双歧杆菌菌种悬浊液吸光度，再根据吸光度与菌体浓度之间的标准曲线，可求得菌体浓度(测菌体吸光度前，需洗涤菌体培养液数次，以除去培养液本身颜色)．

1.2.4 长双歧杆菌生长曲线测定

实验中分别以菊糖、菊糖酶解所得低聚果糖代替活化培养基中的葡萄糖(加入量为1%)，初始pH 7.0，接种量10%，37,℃培养30,h，每隔6,h测定1次长双歧杆菌菌体浓度，绘制其生长曲线．

1.2.5 长双歧杆菌代谢产物分析

用酸度计测定代谢产物pH，采用苯酚硫酸法测定总糖浓度．

1.2.6 不同浓度的葡萄糖、菊糖及菊糖酶解低聚果糖1.2.6 对长双歧杆菌生长的影响

在以葡萄糖为碳源的培养基中，加入葡萄糖的量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，在以菊糖为碳源的培养基中，加入菊糖的量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，在以菊糖酶解低聚果糖为碳源的培养基中，加入菊糖酶解低聚果糖的量分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，测定在这些培养基中长双歧杆菌的生长情况．

1.2.7 长双歧杆菌形态观察

采用JSPM-5200型原子力显微镜(日本JEOL)观察长双歧杆菌形态．制片前将长双歧杆菌用清水多次洗涤，离心，除去培养基，用蒸馏水稀释到适合倍数，用毛细管滴在干净的盖玻片上，常温常压下晾干，备用．原子力扫描采用轻敲模式．

2 结果与讨论

2.1 长双歧杆菌浓度标准曲线

在波长620,nm处测得长双歧杆菌培养液的吸光度与菌体质量浓度之间相关曲线如图1所示，回归方程为y＝4.158x＋0.082 3，R2＝0.989 6．

图1 长双歧杆菌菌体质量浓度标准曲线Fig.1 Standard curve of concentration of Bifitdobacterium Fig.1 longum

2.2 菊糖及其酶解产物对长双歧杆菌增殖影响的比较

2.2.1 对菌体质量浓度的影响

长双歧杆菌生长曲线如图2所示．从图中可以看出：在以低聚果糖作为碳源的培养基中，长双歧杆菌生长最快，最先达到生长对数期，在12,h时菌体质量浓度达到最高，为0.41,g/L，是初始菌体质量浓度的4.5倍；在以菊糖为碳源的培养基中，18,h时达到顶峰，菌体质量浓度为0.37,g/L，是初始菌体质量浓度的4.1倍，之后出现缓慢下降；在以葡萄糖为碳源的培养基中，长双歧杆菌生长最慢，菌体质量浓度也低，在24,h时为0.30,g/L，是初始菌体质量浓度的3.3倍．由此可见，菊糖和低聚果糖对长双歧杆菌的增殖有促进作用，其中低聚果糖的促进效果更为明显．

图2 长双歧杆菌生长曲线Fig.2 Grow th curve of Bifitdobacterium longum

2.2.2 发酵过程中发酵液pH的变化

发酵液pH的变化如图3所示．从图3可以看出：各培养基的pH都是在0～6,h下降最快，6,h后下降速度趋于缓慢．经过6,h培养，以低聚果糖作为碳源的培养基的pH由初始的7.0下降到5.5；以菊糖为碳源的培养基pH由初始的7.0下降到5.8；以葡萄糖为碳源的最慢，pH由初始的7.0下降到6.0．pH下降的这种现象是完全符合长双歧杆菌的生理特性的，即它们在生长过程代谢产生大量的醋酸、乳酸或B族维生素等代谢产物[8]，使培养基pH降低．

图3 长双歧杆菌培养基pH变化Tab.3 Change of pH in culture medium

2.2.3 发酵液中糖含量的变化

2.3 葡萄糖、菊糖及菊糖酶解低聚果糖浓度对长双歧杆菌生长的影响

长双歧杆菌增殖培养基中不同浓度的葡萄糖、菊糖和菊糖酶解低聚果糖对长双歧杆菌增殖的影响如图5—图7所示．

图4 长双歧杆菌培养基总糖含量变化Fig.4 Change of concentration of deoxidization suger in culture medium

图5 不同浓度葡萄糖、菊糖和低聚果糖对长双歧杆菌增殖的影响Fig.5 Effect of different concentration of glucose，inulin and oligomerization levulose on Bifitdobacterium longum proliferation

发酵液中总糖含量的变化如图4所示．从图中可以看出：培养30,h后，低聚果糖的消耗量最多，由最初的9.20,mg/m L下降到4.18,mg/m L，消耗率为52.9%；其次为菊糖，由9.20,mg/m L下降到4.70,mg/m L，消耗率为48.9%；最后为葡萄糖，由9.20,mg/m L下降到5.12,mg/m L，消耗率为40.6%．

从图5(a)可以看出，培养基中葡萄糖浓度为2.0%时长双歧杆菌菌体质量浓度在培养24,h达到0.32,g/L，此后再增加葡萄糖的加入量，菌体质量浓度变化不大．从图5(b)可以看出，培养基中菊糖浓度在2.0%时长双歧杆菌菌体质量浓度在培养18,h达到0.45,g/L，此后再增加菊糖的投入，菌体质量浓度变化不大．从图5(c)可以看出，培养基中菊糖酶解低聚果糖浓度在2.0%时长双歧杆菌菌体质量浓度在培养12,h达到0.5,g/L，此后再增加低聚果糖的投入，菌体质量浓度变化不大．

由此可见，长双歧杆菌在碳源为菊糖和菊糖酶解低聚果糖的培养基中生长旺盛，在碳源为葡萄糖的培养基中，长双歧杆菌达到最高菌体质量浓度0.32,g/L时葡萄糖加入量为2.0%，但在以菊糖或低聚果糖为碳源的培养基中，达到相同的菌体质量浓度时，菊糖或低聚果糖的加入量仅为0.5%，并且在加入低聚果糖培养12,h后就可达到相同的菌体质量浓度．因此，得到相同数量的长双歧杆菌，菊糖或菊糖酶解低聚果糖的用量更少，培养时间更短，从而可以达到降低成本，提高经济效益的效果．

2.4 原子力显微镜下长双歧杆菌的形态

图6为长双歧杆菌在以菊糖和葡萄糖为碳源培养基中的菌体形态的原子力显微镜照片．

图6 长双歧杆菌菌体形态Fig.6 Thallus shape of Bifitdobacterium longum

图6中右侧图片为显微镜照片的立体效果图．长双歧杆菌新分离菌株多呈Y或V型、刀状或棒状，经继代培养后常呈直或曲棒状，也可呈枝状[9]．由于观察到的是长双歧杆菌经过继代后的形态，因此，图中长双歧杆菌呈直棒状或曲棒状，长为1～3,µm，宽为0.5,µm，高为0.4～0.7,µm．不同碳源的培养基中长双歧杆菌的形态无明显差别，说明菊糖在促进长双歧杆菌增殖的同时不会对长双歧杆菌的形态造成影响．

3 结 论

长双歧杆菌在以菊糖和低聚果糖为碳源的培养基中的增殖情况均好于以葡萄糖为碳源，得到相同数量的长双歧杆菌，菊糖或菊糖酶解低聚果糖的用量要少于葡萄糖的用量，培养时间也大大缩短，从而可以达到降低成本，提高经济效益的效果．长双歧杆菌在分别以菊糖和葡萄糖为碳源的培养基中形态无明显差别，说明菊糖在促进长双歧杆菌增殖的同时不会影响其菌体形态．

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Promoting Effect of Inulin and Oligomerization Levulose on the Grow th of Bifitdobacterium Longum

ZHANG Jian-ping1，ZHANG Ze-sheng2，WANG Jin-ju2
(1. College of Marine Science and Engineering，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2. College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China)

TS245.9

A

1672-6510(2011)02-0017-04

2010–09–30；

2011–01–11

天津科技大学科学研究基金资助项目(20090214)

张建平（1982—），女，天津人，助理实验师，硕士，zhangjianping@tust.edu.cn.