EphA2和E-cadherin蛋白在肾透明细胞癌中表达及其意义

段有军,李解方,曹友汉,刘志文

(南华大学附一院泌尿外科,湖南衡阳421001)

EphA2受体是已发现14种生促红素人肝细胞(Erythropoietin-producing hepatoma cell line,Eph)受体中的一员,其基因位于被认为是肿瘤“热点”的染色体lp36.1[1]。EphA2基因是肿瘤相关基因,EphA2蛋白在多种人体肿瘤组织中过度表达,且过度表达与肿瘤的恶性程度及肿瘤的侵袭转移有关[2]。上皮型钙黏蛋白(E-cadherin,E-cad)基因是肿瘤抑制基因,E-cad蛋白调节细胞与细胞间、细胞与细胞外基质间黏附反应,对维持组织形态结构起重要作用,其表达减弱可以引起多种肿瘤的浸润转移[3]。国内关于EphA2和E-cad两种蛋白在肾透明细胞癌方面的研究很少见报道。本实验采用免疫组化SP法检测EphA2与E-cad蛋白在肾透明细胞癌组织(RCCC)中的表达及二者相关性,这对于预测肾透明细胞癌转移、评估预后以及制订合理治疗方案具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 标本采集与制备 收集74例来自南华大学第一附属医院、第二附属医院自1999年至2008年存档肾透明细胞癌石蜡标本。28例正常肾组织标本均取自肾破裂行肾切除的肾脏,病理诊断为正常肾组织。标本均由10%福尔马林固定,常规石蜡包埋。蜡块切片,做免疫组织化学染色。回顾分析入选病例的临床特征:年龄29-71岁,平均年龄42.3岁;肿瘤大小1.5-10.5 cm,平均5.6 cm;根据 2002年AJCC肾癌临床分期:Ⅰ期13例,Ⅱ期20例,Ⅲ期36例,Ⅳ期5例。经病理证实无淋巴结转移39例;有淋巴结转移35例。所有石蜡标本(包括NK、RCCC)均连续切片,片厚约4 μ m,共6张。其中1张作常规HE染色,2张作EphA2,E-cad免疫组化染色,1张以PBS液代替抗体作为阴性对照,其余2张备用。

1.2 免疫组化染色(SP法)检测 采用SP二步法。浓缩型兔抗人EphA2多克隆抗体购于武汉博士德生物技术有限公司,浓缩型兔抗人E-cad单克隆抗体、免疫组织化学染色SP试剂盒和即用型DAB试剂盒、多聚赖氨酸购于北京中杉金桥生物技术有限公司。石蜡切片经抗原修复和血清封闭后,在切片上滴加1∶1 000抗EphA 2抗体及 1∶130抗E-cad抗体,4℃过夜,次日滴加1∶200生物素标记的第二抗体及链霉菌抗生物素2过氧化物酶,DAB显色,苏木精对比染色,用已知EphA2蛋白阳性染色的乳腺癌石蜡切片为阳性对照,E-cad阳性染色的正常胃组织石蜡切片为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判断 EphA2及E-cad染色程度判断:染色结果以染色强度结合阳性细胞数百分比综合计分作半定量分析[3-4]。组织切片中胞质染为淡黄色至棕褐色者为阳性细胞标志。染色强度以多数细胞呈现的染色特性(染色深浅需与背景着色相对比)计分:0分为无色,1分为淡黄色,2分为棕黄色,3分为棕褐色。阳性细胞百分比即某类细胞5个视野(每400×高倍视野计数100个此类细胞)的阳性细胞平均数:0分为阴性,1分为阳性细胞≤10%,2分为11%-50%,3分为51%-75%,4分为＞75%。染色强度与阳性细胞百分比的乘积0-2分为阴性,记作“-”;3-12分为阳性,记作“+”。

1.4 统计学处理 EphA2及E-cad蛋白表达与各临床病理指标的关系应用SPSS12.0统计学软件,采用χ2检验。相关性采用Spearman等级相关分析。以P＜0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 EphA 2蛋白的表达 EphA2蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达明显高于正常组织(P＜0.05)(图1和表1);随着肾透明细胞癌临床分期的升高,EphA 2蛋白的表达逐渐增加(P＜0.05)(表2);有淋巴结转移组的表达明显高于无淋巴结转移组(P＜0.05)(表 3)。

表1 EphA2蛋白在NK、RCCC组织中的表达

图1 EphA2蛋白在 NK中(A)和 RCCC中(B)的表达(SP×400)

表2 EphA2蛋白在RCCC不同临床分期中的表达

表3 EphA2蛋白在RCCC无淋巴结转移组和淋巴结转移组的表达

2.2 E-cad蛋白的表达 E-cad蛋白在肾透明细胞癌组织中的表达明显低于正常组织(P＜0.05)(图2,表4);随着肾透明细胞癌临床分期的升高,E-cad蛋白的表达逐渐减少(P＜0.05)(表5);有淋巴结转移组的表达明显低于无淋巴结转移组(P＜0.05)(表6)。EphA2蛋白和E-cad蛋白的表达在肾透明细胞癌患者中呈显著负相关(P＜0.05)。

图2 E-cad蛋白在NK中(A)和RCCC中(B)的表达(SP×400)

表4 E-cad蛋白在 NK、RCCC组织中的表达

表5 E-cad蛋白在RCCC不同临床分期系统中的表达

表6 E-cad蛋白在RCCC无淋巴结转移和淋巴结转移的表达

2.3 EphA2与E-cad在RCCC中表达的相关性

74例肾透明细胞癌组织中,经Spearman等级相关分析(r=-0.404,P＜0.05),说明EphA2与E-cad在肾透明细胞癌中的表达有密切关系且呈负相关。

3 讨论

本研究结果还显示,EphA2蛋白和E-cad蛋白在RCCCⅢ-Ⅳ期组中的表达分别明显高于和低于Ⅰ-Ⅱ期,在有淋巴结转移组中的阳性表达率分别明显高于和低于无淋巴结转移组,提示EphA2蛋白的过表达和E-cad蛋白的低表达与RCCC临床分期和淋巴结转移密切相关。EphA2的过表达不仅能导致正常细胞的恶性转化,而且能增强肿瘤细胞向外侵袭的能力,这是通过消弱肿瘤细胞之间的连接,增强肿瘤细胞和ECM的黏附和增强在基质的侵袭等几方面实现的[2]。Herrem等[5]在对34例肾细胞癌(RCC)患者的肿瘤组织的研究中发现,不管其组织病理学分级如何,EphA2蛋白高表达的RCC肿瘤其临床分期更高更容易发生淋巴转移。因此我们认为EphA2蛋白参与了RCCC的临床进展,对判定患者的预后提供一定参考。E-cad蛋白表达减少或缺失则使肿瘤细胞丧失接触抑制而无限制增生,失去分化,细胞间连接松散,易于脱落并获得较强的侵袭能力,极易扩散和转移。在多种常见肿瘤中都发现E-cad蛋白表达水平明显降低,且下降水平与肿瘤组织侵袭性生长和远处转移明显相关[10],因此认为E-cad蛋白与肿瘤的分化程度和侵袭能力密切相关。本实验的结果亦提示E-cad蛋白促进了RCCC的临床进展。

研究发现在上皮细胞,EphA2蛋白在细胞与细胞连接区的定位需要E-cad蛋白调节[11]。在EphA2蛋白与配体结合及降解过程中,E-cad蛋白的调控起到了关键性的作用,因为E-cad蛋白表达的下降及功能的缺失导致细胞间的黏附性降低,一方面引起EphA2蛋白受体磷酸化障碍及降解减少,使EphA2蛋白受体和配体不能有效结合,使失磷酸化EphA2蛋白聚积及功能障碍,进而触发了致癌信号级联,另一方面使得癌细胞容易脱离黏附,游离、播散,侵袭性增强。本研究结果显示EphA2蛋白表达与E-cad蛋白表达呈负性相关,推测两者对于RCCC的发生、发展及恶性侵袭性有促进作用。

本研究结果揭示EphA2蛋白过高表达、E-cad蛋白的低下表达可能与RCCC的发生有关,同时促进了临床进展和淋巴结转移。同时也表明E-cad蛋白与EphA2蛋白在肾透明细胞癌中存在负相关,二者的检测可作为RCCC的预后评估的一个指标。

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