小飞蓬活性成分对乳腺癌MCF-7细胞的作用

吴珊珊,郭,张丽红,邱心如,王医术*,严铭铭

(1.吉林大学病理生物学教育部重点实验室,吉林长春130021;2.吉林大学药学院2009级,3.长春中医药大学)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,在我国占全体恶性肿瘤的7%-10%[1],严重威胁妇女身心健康甚至危及生命。而据文献报道,中药小飞蓬除了具有较强的抗氧化,抗衰老,抗突变,调血脂的药理作用外,还具有较强的抗肿瘤作用。因此,本实验研究小飞蓬活性物质对乳腺癌MCF-7细胞的抗肿瘤作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 人乳腺癌MCF-7细胞,购于上海中科院细胞研究所。

1.1.2 主要试剂 CCK-8购至Dojindo公司;5-氟尿嘧啶购至天津金耀氨基酸公司;免疫组织化学染色试剂盒购至福州迈新生物技术公司;MMP-9购至BD公司,Caspase-3购至Gene公司;小飞蓬活性物质由长春中医学院提取提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 MCF-7细胞培养于含10%FCS的H-DMEM培养基中。

1.2.2 CCK-8试剂盒测定药物对细胞生长的抑制作用 取对数生长期的MCF-7细胞,以2×104◦mL-1加入96孔板内,0.1 mL-1孔。小飞蓬作用组按照浓度 1.28、0.64、0.32、0.16、0.08、0.04 mg.L-1分成 6组,每组设 2个平行孔;5-FU为阳性对照,按照0.025 、0.0125 、0.00625 、0.003125 、0.001563 、0.000782 mg◦mL-1分成6组,每组亦设2个平行孔;设2个不加药的为阴性对照。常规培养72 h后,小心吸弃上清,每孔加入含 10 μ L CCK-8 的 RPMI-1640 0.1 mL。另设一孔仅加入含 10 μ L CCK-8的 RPMI-1640 0.1 mL为空白对照孔,37℃、5%CO2培养3 h后,在Biored 550酶标仪上以空白对照孔调零后,在490 nm波长下测定吸光光度值(A值),计算小飞蓬及5-FU对MCF7的生长抑制率,求出IC50。细胞生长抑制率(%)=(对照孔A值—加药孔A值)/对照孔A值×100%。

1.2.3 绘制生长曲线 取对数生长期MCF-7细胞,调整细胞浓度为9×104◦mL-1,接种。根据 IC50值,小飞蓬组设3个浓度组,分别为低剂量组(1/2 IC50值)、中剂量组(IC50值)、高剂量组(2×IC50值),阳性对照组5-FU浓度为IC50值,阴性对照组不加药(0mg◦mL-1)。每个浓度设3个复孔,37℃、5%CO2孵育。共计数7天,绘制生长曲线。

1.2.4 免疫细胞化学染色 常规细胞爬片(细胞密度及药物浓度等同于生长曲线)。将爬片水化后,0.3%Triton-X100 40μ L,作用 18m in 后 EDTA 修复液修复,冲洗后滴加阻断剂20 min,血清覆盖15 min,直接加入一抗(稀释比例为1∶200),4℃过夜。按说明滴加二抗、三抗后DAB发色。苏木精复染细胞核,常规脱水透明,中性树脂封片。结果判定:Caspase-3、MMP-9均以胞浆内出现棕黄色颗粒者为阳性。每张爬片选5个不同视野采集图像。统计阳性细胞的灰度值,单位为像素。

2 结果

2.1 小飞蓬对MCF-7细胞的抑制作用

CCK-8试剂盒检测结果显示,小飞蓬对MCF-7细胞的生长有抑制作用,且抑制作用随小飞蓬浓度的升高而增大,其 IC50值为 0.29 mg◦mL-1,5-FU对MCF-7细胞的IC50值为0.0022 mg◦mL-1,P ＜0.05。结果见表1、2。

2.2 小飞蓬作用MCF-7细胞的生长曲线

选择不同药物浓度作用的MCF-7细胞绘制生长曲线,结果显示,小飞蓬对MCF-7细胞的生长有明显剂量依赖性抑制作用,与对照组相比差异明显(P＜0.05),与现有阳性对照药5-FU相比无显著性差异(P＞0.05)。结果见图1。

表1 小飞蓬对MCF-7细胞的生长的抑制

表2 5-FU对MCF-7细胞的抑制作用

2.3 MCF-7细胞形态的变化

倒置相差显微镜下观察药物作用后细胞形态改变:对照组(0 mg◦mL-1)细胞,呈三角形或多角形,粘附性好,折光性强。小飞蓬低剂量组(0.145 mg◦mL-1)细胞呈多角型,死亡较少,粘附性好,折光性较强,状态较好;小飞蓬中剂量组(0.29 mg◦mL-1)细胞变长,死亡较多,粘附性减弱,折光性减弱;小飞蓬高剂量组(0.58 mg◦mL-1)细胞变长,死亡更多,折光性差。5-FU在浓度为0.0022 mg◦mL-1时,细胞呈不规则形,有部分细胞死亡,折光性减弱。结果见图4。

图1 小飞蓬作用MCF-7细胞的生长曲线

图2 小飞蓬作用后24小时后MCF-7细胞的状态(×200)

2.4 MCF-7细胞中Caspase-3的表达

对照组无Caspase-3表达为阴性,小飞蓬组Caspase-3表达较强,随着浓度的增加表达增强,5-FU组为弱表达,小飞蓬2个组Caspase-3表达高于对照组(P ＜0.001),小飞蓬高剂量组(0.58 mg◦mL-1)、中剂量组(0.29 mg◦mL-1)Caspase-3表达与5-FU(P＜0.01)相近,无统计学意义。结果见表3,图3。

表3 MCF-7细胞中Caspase-3的表达

2.5 MCF-7细胞中MMP-9表达情况

MMP-9免疫细胞化学染色结果提示,对照组MMP-9表达为强阳性,小飞蓬组表达弱于对照组,且随着浓度的增高,表达下降(P＜0.001)。结果见表4及图4。

表4 MCF-7细胞中MMP-9的表达

图3 Caspase-3在MCF-7细胞中的表达(×200)

图4 MMP-9在MCF-7细胞中的表达(×200)

3 讨论

乳腺癌已成为我国妇女中发病率最高的恶性肿瘤,虽有手术、放疗、化疗、生物疗法等多种方法,但中药的抗癌作用日益受到人们的重视[2]。小飞蓬(Erigeron canadensis L.)又名祁州一枝蒿、蛇舌草、竹叶艾、鱼胆草、苦蒿,是菊科飞蓬属的一年生草本植物,广泛分布于中国各地。有文献记载小飞蓬的药用有清热利湿、散瘀消肿、改善肾的微循环的功效并且还具有较强抗肿瘤的药理作用[3]。黄酮类成分为小飞蓬抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、治疗心脑血管疾病的主要有效部位[4]。但迄今为止,小飞蓬对MCF-7是否有抑制作用未见报道。本研究通过体外实验观察小飞蓬对MCF-7细胞生长抑制作用。本研究应用CCK-8试剂盒测得小飞蓬可以抑制人乳腺癌MCF-7细胞生长,IC50值为 0.29 mg◦mL-1;进一步通过绘制MCF-7细胞生长曲线观察到,小飞蓬对MCF-7细胞的生长有明显剂量依赖性抑制作用。形态学观察发现小飞蓬作用后MCF-7细胞形态的改变,细胞由多角型、附壁性好逐渐变长,死亡多,胞浆内颗粒增多,折光性差。上述结果均表明小飞蓬可抑制MCF-7生长,并降低细胞粘附性和铺展能力。Caspase为半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶简称,在正常状态下以无活性的酶原形式存在。当在凋亡信号刺激下被激活,上游的Caspase有次序的激活下游的Caspase,形成Caspase级联反应,将凋亡信号传递到凋亡底物。1993年首次发现Caspase参与细胞凋亡过程以来,大量研究表明,Caspase-3在细胞凋亡过程中处于中心地位,是细胞凋亡的主要效应因子[5,6]。Caspase-3蛋白酶是凋亡中最重要的因子,其在Caspase级联反应中处于核心地位,Caspase-3的剪切活化是细胞凋亡发生的关键步骤及一切凋亡信号传导的共同通路,所以该蛋白酶也被称为死亡蛋白酶[7]。本研究通过免疫细胞化学染色检测 Caspase-3在MCF-7细胞中的表达。研究结果表明,小飞蓬作用细胞后Caspase 3的活性明显强于对照组,并呈剂量依赖。因而,我们得出结论,小飞蓬体外对MCF-7细胞的生长抑制作用是通过激活Caspase 3诱导细胞凋亡而实现的。在肿瘤侵袭、转移的复杂过程中,基质金属蛋白酶(MMPs)起着重要的作用。而MMP-2、MMP-9能降解明胶和IV 、V、Ⅶ、X 型基底膜胶原,允许内皮细胞降解并浸润血管基底膜,产生ECM降解产物,从而趋化内皮细胞,激活并固定ECM中的生长因子[8]。研究者在肿瘤的浸润、转移方面发挥着极为重要的作用[9]。闫承慧等在体外培养肺腺癌细胞系,结果发现腺癌细胞产生MMP的能力与其转移能力有一定相关性,转移能力相对高的细胞系中MMP-2与MMP-9的活性均较高,而转移能力相对较低的细胞系中则只表达MMP-2,不表达MMP-9[10]。表明MMP-9的表达与肿瘤高转移能力更为相关。本研究体外实验MMP-9免疫细胞化学染色结果提示,对照组MMP-9表达为强阳性,小飞蓬组表达弱于对照组,且随着浓度的增高,表达下降。说明小飞蓬在体外可抑制MCF-7细胞MMP-9的表达,从而抑制其侵袭能力。

[1]王兴华,袁爱华主编.外科护理学[M].第1版.北京:人民卫生出版社,2010:269.

[2]林吉品.中医药在恶性肿瘤治疗中的作用机理探析[J].光明中医,2009,24(2):207.

[3]刘大奎.灯盏花素治疗糖尿病肾病高粘血症疗效观察[J].湖北中医杂志,2003,25(5):13.

[4]李廷钊,刘文庸,李国栋,等.灯盏细辛提取工艺的研究[J].中国医药工业杂志 2002,3(6);281.

[5]Alao Y,Yamada H,Nakagawa Y.Arsenic-induced apoptosis in malignant cells in vitro[J].Leuk Lymphoma,2000,37:53.

[6]Anuradha CD,Kanno S,Hirano S.Oxidative damage of mitochondria is a preliminary step to caspase-3 activation in fluoride2induced apoptosis in HL260 cells[J].Free Radic Biol Med,2001,31:367.

[7]Jacobson MD,Weil M,Raff MC.Programmed cell death in animal development[J].Cell,1997,88(3):347.

[8]Gonzalez-Avila G,Iturria C,Vadillo F,et al.72-KD(MMP-2)and 92-KD(MMP-9)type IV collagenase production and activity in different histologic types of lung cancer cells[J].J Pathobiology,1998,66:5.

[9]Jones JL,Walker RA.Control of matrix metalloproteinase activity in Cancer[J].J Pathol,1997,183:337.

[10]闫承慧,吴 淼,金 焰,等.不同转移能力的肺腺癌细胞系金属蛋白酶活性分析[J].遗传,2000,22:239.