发光二极管荧光显微镜在基层应用的多中心研究

夏辉 赵冰 李强 欧喜超 王胜芬 赵雁林

痰涂片显微镜检查在结核病防治工作中对于发现传染源、诊断、疗效评价等具有重要作用。目前我国大部分地区使用萋尼染色法（简称Z－N法），其成本低廉、特异度较高，但灵敏度较低。荧光染色方法灵敏度较Z－N法能够提高约10%，且特异度与之相当［1]。然而，普通汞蒸汽灯泡荧光显微镜成本高、灯泡使用寿命短（200～300h左右）、需要专门的暗室等限制了其推广使用。发光二极管在荧光显微镜中的使用降低了荧光显微镜的成本。尽管国内外有一些关于荧光染色发光二极管荧光显微镜（简称LED）检测方法的研究，但其在我国县（区）级实验室应用的可靠性、可行性等尚没有进行系统评估。本研究对内蒙古自治区呼和浩特市赛罕区和林格尔县，江苏省淮安市淮阴区、楚州区，湖南省长沙市宁乡县、常德市桃源县等6个县（区）级实验室LED的使用情况进行系统评估，为LED在中国基层推广使用提供实践经验。

材料和方法

1.研究对象：收集2009年12月至2010年6月间6个结核病防治机构（简称结防机构）就诊的初诊肺结核可疑症状者及正接受治疗的随访肺结核患者，共纳入6208例（痰标本11288份），其中3691例为初诊可疑症状者（6809份痰标本），2509例为随访患者（痰标本4467份），8例（12份标本）没有记录初诊或随访。初诊可疑症状者中29.78%（1099／3691）收 集 3 份 痰 标 本，46.79%（1727／3691）的患者仅收集1份痰标本，其余患者收集2份痰标本；随访患者中79.71%（2000／2509）收集2份痰，20.01%（502／2509）收集1份痰标本，极少数患者收集3份或以上份痰标本。

2.试验方法：每份痰标本制作2张涂片，分别由2名实验室人员用Z－N和LED法进行染色和镜检，镜检过程严格质量控制。

Z－N法染色采用石碳酸复红热染5min，LED法采用金胺O冷染15～20min。Z－N法使用1000×镜观察（100×物镜、10×目镜），LED法在400×镜下观察（40×物镜、10×目镜），具体染色方法及报告标准参见文献［2] 。

3.试剂和材料：Z－N和LED法采用试剂均为商品化试剂（珠海贝索生物技术有限公司，Z－N试剂批号为410021和410042，荧光试剂批号为410021和410051）。发光二极管荧光显微镜为Primo star发光二极管荧光显微镜（蔡司公司）。

4.统计分析：所有数据统一录入Epidata数据库，用SPSS 15.0软件进行分析。两率之间的比较采用卡方检验，两样本均数间比较采用t检验，P＜0.05认为有统计学意义。

5.质量控制：所有参与研究的人员均接受了统一培训，并进行熟练度测试。各项目点使用统一供应试剂。负责两种方法的实验员独立盲法进行实验操作。

6.伦理学：本研究由中国疾病预防控制中心、美国帕斯适宜卫生科技组织及香港公共卫生检测中心伦理委员会评审通过。

结 果

1.Z－N与LED法阳性涂片检出率比较：总纳入患者、初诊可疑症状者及随访患者中使用LED法较Z－N法的阳性涂片检出率均有提高，且均具有统计学意义（P＜0.05）（表1）。若不将镜检结果是实际条数（Z－N法：1～8条／300视野；LED法：1～9条／50视野）判断为阳性，则Z－N法和LED法的阳性检出率分别为7.97%（900／11288），和8.93%（1008／11288），后者较前者增加0.96%。

表1 6个实验室不同来源标本2种镜检方法痰涂片阳性检出率比较

各实验室2种方法在总患者、初诊可疑症状者及随访患者中痰涂片阳性检出率的具体情况见表1。初诊可疑症状者中阳性检出率提高幅度最大达11.74%，最小仅0.30%，除3号实验室外其他实验室2种方法阳性涂片检出率差异均有统计学意义（P＜0.05）；而在随访患者中，2个实验室使用LED与Z－N法检出率持平，除4号实验室有13.79%的提高外，其他实验室的提高幅度在0.76%～1.65%之间。

2.Z－N与LED法镜检结果分布差异分析：11288张涂片使用Z－N和LED法检测有2.91%（328／11288）存在定性差异。其中，Z－N 法为阴性的涂片有311张LED法判为阳性，其中有73.63%（229／311）被判读为1～9条／50视野；相反，LED法为阴性的有10张涂片被Z－N法判为1～8条／300视野（表2）。

3.读片时间比较分析：使用Z－N法的平均读片时间［（206.31±75.86）s] 明显较LED法［（120.03±38.88）s] 长（t＝28.12，P＝0.00）。其中，阴性结果使用LED法的平均时间较Z－N法短89.04s（t＝30.47，P＝0.00）；阳性结果使用LED法的平均时间［（82.11±53.71）s] 较Z－N法［约（134.79±93.66）s] 节省52.68s（t＝4.39，P＝0.00）。2种方法阅读不同阳性级别涂片所花费的时间见表3。

讨 论

本研究采用多中心研究方法评估了LED法在我国县（区）级实验室应用情况。结果显示LED法的阳性涂片检出率较Z－N法无论是在初诊还是随访患者中均有提高，提示使用LED法不仅可以提高涂阳患者发现率，对疗效判断也会有较大影响。Steingart等［1]通过回顾多篇文章发现，荧光染色传统荧光显微镜较Z－N法阳性检出率增加值范围多数在0%～3%，但是其中几项研究阳性检出率增加值高达19%～33%，故平均阳性检出率提高为9%（95%CI：5%～13%）。本研究结果Z－N法阳性涂片检出率范围为4.33%～11.96%，LED法阳性涂片检出率范围为5.06%～24.26%。LED法较Z－N法阳性检出率增加值范围为0.35%～12.79%。各县（区）结果差异较大，与各地肺结核疫情、患者就诊时间是否延迟、实验室操作技术等均有关联。

表2 Z－N和LED法镜检结果分析（单位：份）

表3 不同涂片结果在两种方法中的读片时间分析

Z－N和LED法存在定性差别的涂片中60%以上来自于某一实验室。国家参比实验室对此实验室LED法涂片镜检的203张涂片（其中15张阴性，181张结果为“1～9条／50视野”和7张“1＋”）进行了Z－N法复检，结果显示，虽然该实验室省级荧光显微镜复检与县级LED法结果有较高的一致性（粗一致率约88.18%），但县级检测为“1～9条／50视野”的181张涂片中仅6张被Z－N法复检为阳性，其余175张全部判断为阴性，占96.69%。此实验室LED法初检和使用传统荧光显微镜复检结果一致性较好；但用脱色后使用Z－N法复检，大部分实际条数的涂片被判为阴性结果，可能有以下几方面原因：（1）由于涂片结果本身是低阳性级别，含菌量少，在重新脱色和复染过程中少量菌丢失致使再次复检时判为阴性结果。（2）Z－N法对低阳性级别结果涂片判读本身存在一定局限性。（3）使用LED法在菌量较少情况下对菌的形态不容易辨认，因为无论是县（区）级还是省级以往均没有很多荧光镜检方面的经验，所以可能在判断时发生误差。

国际指南建议使用明场显微镜读片至少5min［3]，本研究显示在常规工作状态下使用Z－N法读片时间不足4min，使用LED法约2min，时间明显缩短，尤其表现在判读阴性及阳性级别较低的涂片时。但同时需要注意的是本研究中使用Z－N法的读片平均时间略短于国际指南推荐的5min，这也可能是影响阳性患者检出率的一个可能原因，有报道50%的患者在常规工作中由于读片时间不足可能被丢失［4]。

中国结核病防治规划实施指南要求初诊者收集3份痰标本，随访患者收集2份痰标本，但本研究显示两类人群均有部分患者没有能够按照要求收集痰标本。收集3份痰标本较单独采集1份或2份痰标本在阳性检出率方面均有一定程度提高，但是痰标本的数量对于累计阳性检出率提高的影响在两种镜检方法有所不同。收集2份痰标本使用Z－N和LED法镜检累计丢失涂阳患者分别为10%和6%左右。一项综述结果显示，收集2份痰标本且镜检质量良好可以发现绝大部分（95%～98%）的涂阳患者［5]。这与本研究的结果有所差异，可能与痰标本性状、读片时间、人员经验等有一定关系。

从本研究结果可以看出，LED与Z－N法相比阳性检出率提高。其他研究结果显示：若以培养为金标准，LED法的敏感度为84.0%，特异度为98.0%；与明场显微镜相比较，敏感度可提高6.0%，特异度没有明显降低；LED法与传统荧光显微镜相比较，敏感度可提高5.0%，特异度可提高1.0%［1]。另外LED法可明显缩短读片时间，且染色时不需要加热，此外操作人员对显微镜的对比度、信噪比、荧光均匀程度、聚焦容易度等评价均较满意。但是在替换现有显微镜时需要考虑以下几方面：（1）荧光染色抗酸菌形态不如Z－N法典型，尤其是菌量少的情况下不易与杂质区分，对于不熟悉荧光镜检技术的实验人员更加明显。（2）荧光染色涂片与Z－N法染色比较更加容易褪色，在实施痰涂片盲法复检时需要将涂片重新脱色和染色之后进行复检，增加复检实验室人员工作负荷。（3）在日样本量低、且每日分多批次操作的实验室，由于荧光染色时间较现有方法长（分别为15～20min、5min），可能需要较多的时间报告结果。综合各方面，可优先考虑选择日工作量较大的实验室应用LED法，然后逐步扩展至其他实验室。

志谢 感谢3省及6个县区级实验室工作人员在研究现场的辛勤工作。感谢香港跨国结核病参比实验室、美国帕斯适宜卫生科技组织在数据分析和撰写过程中给予的指导和帮助

［1] Steingart KR，Henry M，Ng V，et al.Fluorescence versus conventional sputum smear microscopy for tuberculosis：a systematic review.Lancet Infect Dis，2006，6（9）：570－581.

［2] 赵雁林.中国结核病防治规划——痰涂片显微镜检查标准化操作及质量保证手册.北京：中国协和医科大学出版社，2009：7.

［3] International Union Against Tuberculosis and Lung Disease（IUATLD）technical guide.sputum examination for tuberculosis by direct microscopy in low－income countries.5th ed.Paris：IUATLD.2000.

［4] Cambanis A，Ramsay A，Wirkom V，et al.Investing time in microscopy：an opportunity to optimize smear－based case detection of tuberculosis.Int J Tuberc Lung Dis，2007，11（1）：40－45.

［5] Mase SR，Ramsay A，Ng V，et al.Yield of serial sputum specimen examinations in the diagnosis of pulmonary tuberculosis：a systematic review.Int J Tuberc Lung Dis，2007，11（5）：485－495.